| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-20页 |
| 1.1 乳酸克鲁维酵母概述 | 第9-13页 |
| 1.1.1 乳酸克鲁维酵母的发现 | 第9页 |
| 1.1.2 乳酸克鲁维酵母的分类地位 | 第9-10页 |
| 1.1.3 乳酸克鲁维酵母作为优良宿主菌株在外源蛋白表达中的优势 | 第10-12页 |
| 1.1.4 乳酸克鲁维酵母的应用 | 第12-13页 |
| 1.2 乳酸克鲁维酵母表达系统的研究现状 | 第13-16页 |
| 1.2.1 表达载体 | 第13页 |
| 1.2.2 启动子 | 第13-14页 |
| 1.2.3 信号肽 | 第14-15页 |
| 1.2.4 筛选标记 | 第15-16页 |
| 1.2.5 报告基因 | 第16页 |
| 1.3 rDNA作为同源重组整合位点的研究 | 第16-18页 |
| 1.3.1 rDNA的结构及功能 | 第17页 |
| 1.3.2 rDNA在同源重组中的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.4 本课题的立题意义及研究内容 | 第18-20页 |
| 1.4.1 立题意义 | 第18-19页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第19-20页 |
| 第二章 材料与方法 | 第20-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-25页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第20-21页 |
| 2.1.2 引物 | 第21页 |
| 2.1.3 培养基 | 第21-24页 |
| 2.1.4 工具酶与主要试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.5 实验溶液的配制 | 第25页 |
| 2.1.6 主要实验仪器和设备 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-32页 |
| 2.2.1 酵母染色体基因组的提取(酸性玻璃珠法) | 第25-26页 |
| 2.2.2 目的片段PCR扩增 | 第26页 |
| 2.2.3 目的片段与载体的连接 | 第26-27页 |
| 2.2.4 常规分子生物学操作 | 第27页 |
| 2.2.5 E. coli JM109感受态细胞的制备及转化 | 第27页 |
| 2.2.6 K. lactis感受态细胞的制备及转化 | 第27-28页 |
| 2.2.7 重组菌菌落PCR验证 | 第28页 |
| 2.2.8 单拷贝整合重组菌的筛选 | 第28页 |
| 2.2.9 不同启动子调控下重组菌胞内EGFP的表达与检测 | 第28-29页 |
| 2.2.10 菌体的培养 | 第29页 |
| 2.2.11 AMP脱氨酶酶活性的检测 | 第29-30页 |
| 2.2.12 内参基因GAPDH的克隆及标准质粒的构建 | 第30页 |
| 2.2.13 GAPDH基因和AMPD基因RT-QPCR反应的标准曲线 | 第30页 |
| 2.2.14 K. lactis/pTRGA-amdS中AMPD基因拷贝数的测定 | 第30-31页 |
| 2.2.15 重组酵母生长曲线的测定 | 第31页 |
| 2.2.16 重组酵母菌株质粒稳定性分析 | 第31-32页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第32-53页 |
| 3.1 不同启动子在K. lactis GG799中的功能研究 | 第32-40页 |
| 3.1.1 缺失KlLAC4启动子功能的表达载体pKLAC1*的构建 | 第32-33页 |
| 3.1.2 启动子与报告基因egfp的克隆 | 第33-34页 |
| 3.1.3 重组表达载体pKLAC1*-promoter-egfp的构建 | 第34-35页 |
| 3.1.4 K. lactis/pKLAC1*-promoter-egfp的构建与验证 | 第35页 |
| 3.1.5 不同启动子调控下单拷贝整合重组菌的筛选 | 第35-37页 |
| 3.1.6 重组菌胞内EGFP的观察 | 第37-38页 |
| 3.1.7 重组菌荧光强度的定量测定 | 第38-39页 |
| 3.1.8 小结 | 第39-40页 |
| 3.2 不同信号肽在K. lactis GG799中的功能研究 | 第40-44页 |
| 3.2.1 信号肽与报告基因AMPD的克隆 | 第40-41页 |
| 3.2.2 重组表达载体pKLAC1-sp-AMPD的构建 | 第41-42页 |
| 3.2.3 K. lactis/pKLAC1-sp-AMPD的构建与验证 | 第42页 |
| 3.2.4 不同信号肽引导下单拷贝整合重组菌的筛选 | 第42-43页 |
| 3.2.5 重组菌AMP脱氨酶酶活的测定 | 第43-44页 |
| 3.2.6 小结 | 第44页 |
| 3.3 整合型表达载体pTRGA-amdS的构建及初步验证 | 第44-53页 |
| 3.3.1 功能元件、18S rDNA的克隆及组装 | 第44-47页 |
| 3.3.2 K. lactis/pTRGA-amdS的构建与验证 | 第47-48页 |
| 3.3.3 K. lactis/pTRGA-amdS中AMPD基因拷贝数的测定 | 第48-50页 |
| 3.3.4 重组菌AMPD基因拷贝数与AMP脱氨酶酶活的关系 | 第50-51页 |
| 3.3.5 培养基成分对K. lactis/pTRGA-amdS产酶的影响 | 第51页 |
| 3.3.6 整合载体对重组菌生长的影响 | 第51-52页 |
| 3.3.7 重组菌株稳定性测定 | 第52页 |
| 3.3.8 小结 | 第52-53页 |
| 主要结论与展望 | 第53-55页 |
| 主要结论 | 第53页 |
| 展望 | 第53-55页 |
| 致谢 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第61页 |
| 期刊论文 | 第61页 |
| 参与工作的期刊论文 | 第61页 |
| 参与工作的科研项目 | 第61页 |
