| 致谢 | 第5-7页 |
| 中文摘要 | 第7-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 插图和附表清单 | 第14-17页 |
| 缩写及符号清单 | 第17-22页 |
| 1 引言 | 第22-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-68页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-31页 |
| 2.1.1 临床胃癌病例信息及组织样本的收集 | 第25页 |
| 2.1.2 细胞培养 | 第25-26页 |
| 2.1.3 动物饲养 | 第26页 |
| 2.1.4 试剂和仪器 | 第26-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-68页 |
| 2.2.1 RNA提取 | 第31-33页 |
| 2.2.2 cDNA合成 | 第33页 |
| 2.2.3 实时定量荧光PCR法(Real-Time PCR)检测组织及细胞系中目的基因的表达 | 第33-35页 |
| 2.2.4 逆转录RT-PCR检测检测组织及细胞系中目的基因的表达 | 第35-36页 |
| 2.2.5 提取总蛋白以及蛋白浓度检测 | 第36-37页 |
| 2.2.6 蛋白免疫印迹(Western Blot)分析 | 第37-40页 |
| 2.2.7 甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP) | 第40-45页 |
| 2.2.8 亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing,BGS) | 第45-47页 |
| 2.2.9 5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza)和trichostatin A(TSA)处理细胞 | 第47页 |
| 2.2.10 实验相关表达载体的构建和转染 | 第47-58页 |
| 2.2.11 siRNA靶向干扰技术 | 第58页 |
| 2.2.12 组织病理分析 | 第58-60页 |
| 2.2.13 分析大型癌症和肿瘤基因数据库(Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO) | 第60-61页 |
| 2.2.14 细胞活性实验 | 第61-63页 |
| 2.2.15 细胞迁移、侵袭和粘附实验 | 第63-64页 |
| 2.2.16 建立稳定过表达SCNN1B的裸鼠皮下成瘤模型 | 第64-65页 |
| 2.2.17 免疫共沉淀与质谱分析 | 第65页 |
| 2.2.18 免疫荧光染色 | 第65-66页 |
| 2.2.19 统计学方法 | 第66-68页 |
| 3 技术路线 | 第68-70页 |
| 3.1 SCNN1B体内体外功能实验 | 第68页 |
| 3.2 SCNN1B胃癌临床队列和数据库分析 | 第68-69页 |
| 3.3 SCNN1B抑制胃癌的分子机制研究 | 第69-70页 |
| 4 结果 | 第70-125页 |
| 4.1 全基因组甲基化芯片扫描筛选出SCNN1B为候选抑癌基因 | 第70-71页 |
| 4.2 SCNN1B在胃癌细胞株及胃癌组织中表达沉默与该基因DNA启动子上的CPG岛发生甲基化相关 | 第71-83页 |
| 4.2.1 逆转录PCR检测SCNN1B在正常成人组织中的表达 | 第71页 |
| 4.2.2 逆转录PCR检测SCNN1B在胃癌细胞株及正常胃组织中的表达 | 第71-73页 |
| 4.2.3 甲基化特异PCR及亚硫酸氢盐基因组测序检测基因SCNN1B启动子区甲基化水平 | 第73-76页 |
| 4.2.4 去甲基化试剂5-Aza和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理细胞后检测SCNN1B的复表达水平 | 第76-77页 |
| 4.2.5 检测SCNN1B在临床胃癌组织与配对癌旁正常组织的表达差异,对候选抑癌基因SCNN1B作进一步验证 | 第77-80页 |
| 4.2.6 甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐基因组测序法检测SCNN1B在临床胃癌组织配对样本中启动子甲基化程度的差异 | 第80-81页 |
| 4.2.7 TCGA数据库验证SCNN1B在胃癌组织中的DNA甲基化水平与基因表达水平 | 第81-83页 |
| 4.3 评估SCNN1B在胃癌组织中的表达水平与患者临床特征及生存预后的关系 | 第83-96页 |
| 4.3.1 免疫组化法检测胃癌组织芯片SCNN1B表达水平,评估SCNN1B的蛋白表达水平与胃癌患者临床特征及生存预后间的关系 | 第83-88页 |
| 4.3.2 胃癌数据集GSE62254分析,验证SCNN1B的mRNA表达水平与胃癌临床特征及生存预后的关系 | 第88-94页 |
| 4.3.3 胃癌数据集GSE14210分析,验证SCNN1B的mRNA表达水平与胃癌临床特征及生存预后的关系 | 第94-96页 |
| 4.4 SCNN1B通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,进而抑制胃癌细胞的生长 | 第96-104页 |
| 4.4.1 SCNN1B转染后验证 | 第96-97页 |
| 4.4.2 SCNN1B抑制胃癌细胞增殖 | 第97-98页 |
| 4.4.3 SCNN1B诱导胃癌细胞凋亡和细胞周期阻滞 | 第98-102页 |
| 4.4.4 siRNA靶向敲低SCNN1B增加细胞集落形成能力,同时促进细胞从G_1期进入S期 | 第102-104页 |
| 4.5 SCNN1B可以抑制胃癌细胞的迁移与侵袭、促进细胞的粘附 | 第104-109页 |
| 4.5.1 SCNN1B抑制胃癌细胞的迁移能力 | 第104-106页 |
| 4.5.2 SCNN1B可抑制胃癌细胞的侵袭能力 | 第106页 |
| 4.5.3 SCNN1B可促进胃癌细胞的粘附能力 | 第106-107页 |
| 4.5.4 siRNA靶向敲低SCNN1B促进胃癌细胞的迁移、抑制胃癌细胞的粘附 | 第107-109页 |
| 4.6 SCNN1B抑制胃癌细胞体内成瘤能力 | 第109-113页 |
| 4.6.1 建立稳定转染SCNN1B或空白载体的MKN45裸鼠皮下成瘤模型 | 第110-111页 |
| 4.6.2 建立稳定转染SCNN1B或空白载体的BGC823裸鼠皮下成瘤模型 | 第111-113页 |
| 4.7 SCNN1B与GRP78相互作用,通过泛素化作用降解蛋白GRP78 | 第113-125页 |
| 4.7.1 免疫共沉淀实验联合质谱分析筛选出SCNN1B的候选相互作用蛋白GRP78 | 第113-114页 |
| 4.7.2 验证蛋白SCNN1B与蛋白GRP78的相互作用 | 第114页 |
| 4.7.3 免疫荧光实验确定蛋白SCNN1B与蛋白GRP78在细胞内的定位 | 第114-115页 |
| 4.7.4 探索蛋白SCNN1B与蛋白GRP78之间的相互作用 | 第115-125页 |
| 5 讨论 | 第125-128页 |
| 6 结论 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-133页 |
| 综述 | 第133-153页 |
| 參考文献 | 第143-153页 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 | 第153-158页 |
