| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-17页 |
| 1.1 氨肽酶概述 | 第9-11页 |
| 1.1.1 氨肽酶的来源 | 第9页 |
| 1.1.2 氨肽酶的分类 | 第9-10页 |
| 1.1.3 氨肽酶的应用 | 第10-11页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统概述 | 第11-13页 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统的优缺点 | 第12页 |
| 1.2.2 毕赤酵母上罐工艺 | 第12-13页 |
| 1.3 密码子优化概述 | 第13-14页 |
| 1.3.1 密码子优化概述 | 第13页 |
| 1.3.2 毕赤酵母密码子偏好性及密码子优化应用 | 第13-14页 |
| 1.4 氨肽酶发展现状 | 第14-15页 |
| 1.4.1 国外研究现状 | 第14-15页 |
| 1.4.2 国内研究进展 | 第15页 |
| 1.5 立题意义 | 第15-16页 |
| 1.6 本论文研究内容 | 第16-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-27页 |
| 2.1 材料 | 第17-18页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第17页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第17页 |
| 2.1.3 培养基与溶液 | 第17-18页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第18页 |
| 2.2 实验方法 | 第18-23页 |
| 2.2.1 细菌质粒的提取 | 第18页 |
| 2.2.2 基因组的提取 | 第18页 |
| 2.2.3 目的基因的扩增 | 第18-19页 |
| 2.2.4 plap基因和质粒的双酶切 | 第19页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备 | 第19页 |
| 2.2.6 重组质粒的连接 | 第19-20页 |
| 2.2.7 连接产物转化感受态细胞 | 第20页 |
| 2.2.8 转化子的菌落PCR验证 | 第20页 |
| 2.2.9 重组质粒的双酶切验证 | 第20页 |
| 2.2.10 重组质粒的DNA测序 | 第20页 |
| 2.2.11 重组载体pPIC9K-plap的线性化 | 第20页 |
| 2.2.12 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第20-21页 |
| 2.2.13 电转化毕赤酵母GS115 | 第21页 |
| 2.2.14 重组酵母的筛选 | 第21页 |
| 2.2.15 重组毕赤酵母的表达 | 第21-22页 |
| 2.2.16 重组毕赤酵母产赖氨酸氨肽酶的发酵优化 | 第22-23页 |
| 2.3 密码子优化 | 第23页 |
| 2.3.1 密码子优化方案 | 第23页 |
| 2.3.2 密码子优化结果验证 | 第23页 |
| 2.4 分析方法 | 第23-27页 |
| 2.4.1 酵母生长曲线的测定 | 第23页 |
| 2.4.2 菌体湿重的测定 | 第23页 |
| 2.4.3 赖氨酸氨肽酶酶活的测定 | 第23页 |
| 2.4.4 蛋白浓度的测定 | 第23-24页 |
| 2.4.5 赖氨酸氨肽酶的分离纯化 | 第24-25页 |
| 2.4.6 SDS-PAGE分析 | 第25页 |
| 2.4.7 重组酶的去糖基化分析 | 第25页 |
| 2.4.8 MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析 | 第25页 |
| 2.4.9 重组赖氨酸氨肽酶的酶学性质研究 | 第25-26页 |
| 2.4.10 重组赖氨酸氨肽酶的复配应用初探 | 第26-27页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第27-48页 |
| 3.1 重组赖氨酸氨肽酶菌株毕赤酵母构建与表达 | 第27-30页 |
| 3.1.1 pPIC9K-plap的构建 | 第27-28页 |
| 3.1.2 产赖氨酸氨肽酶菌株的筛选 | 第28-29页 |
| 3.1.3 重组毕赤酵母的表达验证 | 第29页 |
| 3.1.4 重组酵母赖氨酸氨肽酶表达验证 | 第29-30页 |
| 3.2 重组毕赤酵母产酶的摇瓶发酵优化 | 第30-34页 |
| 3.2.1 重组菌的生长曲线 | 第30页 |
| 3.2.2 诱导开始时间对重组菌产酶的影响 | 第30-31页 |
| 3.2.3 初始pH对重组菌产酶的影响 | 第31页 |
| 3.2.4 诱导温度对重组菌产酶的影响 | 第31-32页 |
| 3.2.5 甲醇浓度对重组菌产酶的影响 | 第32-33页 |
| 3.2.6 装液量对重组菌产酶的影响 | 第33页 |
| 3.2.7 Co~(2+)对重组菌产酶的影响 | 第33-34页 |
| 3.2.8 山梨醇添加量对重组毕赤酵母产氨肽酶的影响 | 第34页 |
| 3.3 密码子偏好优化赖氨酸氨肽酶及验证 | 第34-37页 |
| 3.3.1 赖氨酸氨肽酶基因序列的优化设计 | 第34-35页 |
| 3.3.2 plap基因密码子优化结果 | 第35-36页 |
| 3.3.3 密码子优化结果的验证 | 第36-37页 |
| 3.4 重组酶在7L发酵罐上的表达 | 第37-38页 |
| 3.4.1 甘油补料发酵 | 第37-38页 |
| 3.4.2 甲醇补料发酵 | 第38页 |
| 3.5 重组赖氨酸氨肽酶分离纯化 | 第38-42页 |
| 3.5.1 硫酸铵盐析 | 第38-39页 |
| 3.5.2 Hitrap Q HP阴离子交换层析 | 第39页 |
| 3.5.3 Superdex~(TM) 7510/300GL凝胶过滤层析 | 第39-40页 |
| 3.5.4 氨肽酶分离结果及分析 | 第40页 |
| 3.5.5 重组赖氨酸氨肽酶糖基化分析 | 第40-41页 |
| 3.5.6 MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析 | 第41-42页 |
| 3.6 重组赖氨酸氨肽酶的酶学性质 | 第42-46页 |
| 3.6.1 重组氨肽酶的最适pH及pH稳定性 | 第42页 |
| 3.6.2 重组氨肽酶最适反应温度和温度稳定性 | 第42-43页 |
| 3.6.3 金属离子和蛋白酶抑制剂对重组氨肽酶的影响 | 第43-44页 |
| 3.6.4 重组氨肽酶的底物特异性 | 第44-45页 |
| 3.6.5 重组酶动力学常数分析 | 第45-46页 |
| 3.7 重组氨肽酶的应用初探 | 第46-48页 |
| 3.7.1 氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解酪蛋白 | 第46-48页 |
| 主要结论与展望 | 第48-50页 |
| 主要结论 | 第48-49页 |
| 展望 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-55页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第55-56页 |
| 标准曲线 | 第56-58页 |
