稻米脂肪酶基因工程菌的构建及性质研究

【摘要】：脂肪酶(Lipase, E.C.3.1.1.3),全称为三酰基甘油酰基水解酶(triacylglyc-erol acylhydrolase),它属于α／β折叠酶家族,是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶的催化遵循丝氨酸水解酶的反应机制,能够在油水界面上将甘油三酯完全水解成脂肪酸和甘油。因而脂肪酶能够催化脂水解、脂合成和脂交换等多种反应,被应用于油脂处理、洗涤剂、食品加工、精细化工、制药、造纸等多种行业。脂肪酶在动植物的各种组织及微生物中广泛存在。稻米脂肪酶存在于稻谷皮层,其酶活性很高,在稻谷脱壳碾米加工过程中,由于碾下的米糠其细胞结构破坏,脂肪酶和油脂接触后迅速发生酯解反应极易引起米糠酸败,因此,长期以来,国内外均集中在灭酶钝化的研究方向上,而极少关注稻米脂肪酶的开发利用。本研究选定稻米脂肪酶(Rice Lipase, RL)基因作为研究对象,从基因工程的角度,定向克隆稻米脂肪酶基因转入基因工程菌中进行表达,研究RL在大肠杆菌BL21表达系统及毕赤酵母GS115表达系统中的表达情况,对表达后重组脂肪酶的酶学性质进行了初步研究,主要包括温度、pH、表面活性剂、金属离子、不同链长的底物等对脂肪酶活性的影响。主要结论如下(1)酵母表面展示系统是更适合稻米脂肪酶表达的微生物表达系统。(2)稻米脂肪酶的最适作用温度为35-45℃,在55℃保温1h仍能保持97.3%的相对酶活性,在55℃保温3h后能保持80%以上相对的酶活力；最适pH为8.0,在pH7.0到pH10.0范围内都能保持80%以上的酶活力,具有较好的热稳定性及pH稳定性；(3)酵母菌通过高密度发酵可获得大量具有RL活性的菌体,不需要特别的分离提纯和固定化处理,其重复使用5次依然可以保持80%以上的活性；(4)对中短链酯类(C4～C8)表现出更好的水解活性；(5)添加金属离子及表面活性剂也可以提高脂肪酶活性。本文对稻米脂肪酶在大肠杆菌及毕赤酵母两种宿主细胞中的表达情况进行了较为系统的研究,初步探索了更为适合工业化生产的表达载体,并且研究了重组脂肪酶的酶学性质,为以后的应用提供理论依据。
【关键词】：稻米脂肪酶 大肠杆菌 毕赤酵母 酶学性质
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ925.6