| 中文摘要 | 第1-19页 |
| 英文摘要 | 第19-30页 |
| 符号说明 | 第30-32页 |
| 第一部分 TRAIL在脑缺血再灌注致神经元凋亡中的作用及其机制研究 | 第32-74页 |
| 前言 | 第32-36页 |
| 第一章 TRAIL诱导皮层神经元凋亡的体外研究 | 第36-43页 |
| 材料与方法 | 第36-39页 |
| 1.材料 | 第36-37页 |
| 2.方法 | 第37-39页 |
| ·小鼠大脑皮层神经元的体外培养及鉴定 | 第37-38页 |
| ·小鼠大脑皮层神经元的体外培养 | 第37-38页 |
| ·小鼠大脑皮层神经元的鉴定 | 第38页 |
| ·小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测及IFN-γ的影响 | 第38-39页 |
| ·小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测 | 第38-39页 |
| ·倒置相差显微镜下观察形态学变化 | 第38页 |
| ·CCK-8检测细胞杀伤率 | 第38-39页 |
| ·IFN-γ对小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的影响 | 第39页 |
| ·倒置相差显微镜下观察形态学变化 | 第39页 |
| ·CCK-8检测细胞杀伤率 | 第39页 |
| 结果 | 第39-41页 |
| 1 小鼠大脑皮层神经元的体外培养与鉴定 | 第39-40页 |
| ·原代培养小鼠大脑皮层神经元的形态学特点 | 第39-40页 |
| ·皮层神经元特异性烯醇化酶鉴定结果 | 第40页 |
| 2 小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测及IFN-γ的影响 | 第40-41页 |
| ·小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测 | 第40-41页 |
| ·倒置相差显微镜下形态学变化 | 第40页 |
| ·CCK-8检测细胞杀伤率 | 第40-41页 |
| ·IFN-γ对小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的影响 | 第41页 |
| ·倒置相差显微镜下形态学变化 | 第41页 |
| ·CCK-8检测细胞杀伤率 | 第41页 |
| 讨论 | 第41-43页 |
| 第二章 TRAIL在小鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究 | 第43-74页 |
| 第一节 小鼠全脑缺血再灌注模型的建立及相应指标检测 | 第43-57页 |
| 材料与方法 | 第43-47页 |
| 1.材料 | 第43-44页 |
| 2.方法 | 第44-47页 |
| ·全脑缺血再灌注动物模型的建立 | 第44-45页 |
| ·全脑缺血前后脑血流量的变化 | 第45页 |
| ·动物脑组织取材 | 第45页 |
| ·TUNEL检测细胞凋亡 | 第45页 |
| ·半定量RT-PCR检测炎性因子的表达 | 第45-47页 |
| 结果 | 第47-49页 |
| 1.全脑缺血后脑血流量及神经病学症状的变化 | 第47页 |
| 2.TUNEL检测细胞凋亡 | 第47-48页 |
| 3.RT-PCR检测炎性因子的表达 | 第48-49页 |
| ·全脑缺血再灌注后TNFα在小鼠海马和大脑皮层的表达 | 第48页 |
| ·全脑缺血再灌注后TNFα在小鼠海马的表达 | 第48页 |
| ·全脑缺血再灌注后TNFα在小鼠大脑皮层的表达 | 第48页 |
| ·全脑缺血再灌注后IFN-γ在小鼠海马和大脑皮层的表达 | 第48-49页 |
| ·全脑缺血再灌注后IFN-γ在小鼠海马的表达 | 第48页 |
| ·全脑缺血再灌注后IFN-γ在小鼠大脑皮层的表达 | 第48-49页 |
| ·全脑缺血再灌注后ICAM-1在小鼠海马和大脑皮层的表达 | 第49页 |
| ·全脑缺血再灌注后ICAM-1在小鼠海马的表达 | 第49页 |
| ·全脑缺血再灌注后ICAM-1在小鼠大脑皮层的表达 | 第49页 |
| 讨论 | 第49-57页 |
| 第二节 TRAIL及其受体在小鼠全脑缺血再灌注损伤中的表达 | 第57-63页 |
| 材料与方法 | 第57-60页 |
| 1.材料 | 第57-58页 |
| 2 方法 | 第58-60页 |
| ·动物分组及模型制备 | 第58页 |
| ·半定量RT-PCR检测TRAIL及其受体mRNA水平的表达 | 第58页 |
| ·免疫组织化学双荧光染色检测TRAIL及DR5的表达及细胞定位 | 第58-59页 |
| ·免疫组织化学与TUNEL共染检测DR5表达与细胞凋亡的相关性 | 第59页 |
| ·激光共聚焦检测 | 第59-60页 |
| ·ELISA法测定血清中sTRAIL浓度 | 第60页 |
| 结果 | 第60-63页 |
| 1.全脑缺血再灌注后TRAIL及其受体mRNA水平的表达 | 第60-61页 |
| ·全脑缺血再灌注后TRAIL mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后小鼠海马TRAIL mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后小鼠大脑皮层TRAIL mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后DR5mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后小鼠海马DR5mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后小鼠大脑皮层DR5mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后DcR1mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后小鼠海马DcR1mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后小鼠大脑皮层DcR1mRNA水平的表达 | 第61页 |
| ·全脑缺血再灌注后DcR2mRNA水平的表达 | 第61页 |
| 2.免疫双染激光共聚焦检测TRAIL在脑内的表达 | 第61-62页 |
| ·TRAIL、GFAP免疫双染 | 第61-62页 |
| ·TRAIL、ED1免疫双染 | 第62页 |
| ·TRAIL、NSE免疫双染 | 第62页 |
| 3.免疫双染激光共聚焦检测DR5在神经元和星形胶质细胞的表达 | 第62页 |
| ·NSE与DR5免疫共染 | 第62页 |
| ·GFAP与DR5免疫共染 | 第62页 |
| ·TUNEL与DR5免疫共染 | 第62页 |
| 4.血清中sTRAIL检测 | 第62-63页 |
| 第三节 sDR5特异性封闭TRAIL对缺血再灌注损伤神经元的保护作用 | 第63-74页 |
| 材料与方法 | 第63-68页 |
| 1.材料 | 第63-65页 |
| 2.方法 | 第65-68页 |
| ·sDR5蛋白对TRAIL诱导凋亡的封闭效应 | 第65-66页 |
| ·sDR5蛋白的制备、纯化和定量 | 第65-66页 |
| ·sDR5蛋白对TRAIL诱导小鼠大脑皮层神经元凋亡的封闭作用 | 第66页 |
| ·显微镜下观察小鼠大脑皮层神经元的形态学变化 | 第66页 |
| ·CCK-8检测细胞杀伤率 | 第66页 |
| ·sDR5蛋白对体外低氧低糖再灌注损伤小鼠大脑皮层神经元的保护作用 | 第66-68页 |
| ·体外低氧低糖再灌注损伤模型的建立 | 第66-67页 |
| ·sDR5蛋白对体外低氧低糖再灌注损伤大脑皮层神经元保护作用 | 第67-68页 |
| ·显微镜下观察小鼠大脑皮层神经元的形态学变化 | 第67页 |
| ·TUNEL检测细胞凋亡的变化 | 第67页 |
| ·CCK-8法检测细胞存活率 | 第67-68页 |
| ·sDR5对体内缺血再灌注损伤神经元的保护作用 | 第68页 |
| ·动物分组 | 第68页 |
| ·侧脑室注射药物 | 第68页 |
| ·TUNEL检测细胞凋亡 | 第68页 |
| 结果 | 第68-70页 |
| 1.sDR5蛋白的浓度测定及活性鉴定 | 第68-69页 |
| ·sDR5蛋白的鉴定和浓度测定 | 第68-69页 |
| ·sDR5蛋白阻断TRAIL诱导小鼠大脑皮层神经元细胞毒效应 | 第69页 |
| 2.sDR5蛋白对缺血再灌注损伤神经元的保护作用 | 第69-70页 |
| ·sDR5对体外低氧低糖再灌注损伤大脑皮层神经元的保护作用 | 第69页 |
| ·sDR5对体内缺血再灌注损伤神经元的保护作用 | 第69-70页 |
| 讨论 | 第70-74页 |
| 第二部分 GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白穿过血脑屏障的研究 | 第74-105页 |
| 前言 | 第74-81页 |
| 材料与方法 | 第81-97页 |
| 1.材料 | 第81-85页 |
| 2.方法 | 第85-97页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白表达载体的构建 | 第85-91页 |
| ·基因片段的PCR扩增、回收及纯化 | 第85-87页 |
| ·PCR扩增GDNF(ΔN39)-R9基因片段 | 第85-86页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9基因片段的大量扩增、回收与纯化 | 第86-87页 |
| ·目的基因与载体的连接和重组子的转化 | 第87-89页 |
| ·目的基因与载体的酶切、回收与纯化 | 第87-88页 |
| ·目的基因GDNF(ΔN39)-R9与载体pET28a(+)的连接 | 第88页 |
| ·重组质粒pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9的转化 | 第88-89页 |
| ·阳性重组子pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9的筛选与鉴定 | 第89-91页 |
| ·试剂盒小量抽提质粒 | 第89-90页 |
| ·PCR反应筛选阳性重组子pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9 | 第90页 |
| ·酶切筛选阳性重组子pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9 | 第90-91页 |
| ·DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 | 第91页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白表达、纯化、复性及定量 | 第91-92页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白诱导表达 | 第91页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白溶解性分析 | 第91页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白的亲和层析纯化和复性 | 第91-92页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白浓度测定 | 第92页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白生物学功能检测 | 第92-97页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白神经营养活性的检测 | 第92-94页 |
| ·对原代培养中脑多巴胺能神经元的作用 | 第92-94页 |
| ·对PC12-GFRα1-Ret细胞突起生长的影响 | 第94页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白穿越细胞膜及血脑屏障模拟物能力检测 | 第94-97页 |
| ·免疫细胞荧光染色、激光共聚焦显微镜观察及Western-blot检测GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白穿越细胞膜的能力 | 第94-95页 |
| ·Transwell检测GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白穿越血脑屏障模拟物的能力 | 第95-97页 |
| ·Transwell模型的建立 | 第95页 |
| ·免疫共沉淀/Western Blot检测GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白穿越血脑屏障模拟物能力 | 第95-97页 |
| 结果 | 第97-101页 |
| 1.GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白表达载体的构建 | 第97-99页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9基因片段的PCR扩增、回收及纯化 | 第97-98页 |
| ·PCR扩增基因片段 | 第97页 |
| ·回收、纯化PCR产物 | 第97-98页 |
| ·pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9表达载体的构建及鉴定 | 第98-99页 |
| ·目的基因GDNF(ΔN39)-R9和载体pET28a(+)的酶切回收 | 第98页 |
| ·目的基因GDNF(ΔN39)-R9与载体pET28a(+)的连接、转化 | 第98页 |
| ·阳性重组子pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9的筛选和鉴定 | 第98-99页 |
| ·PCR反应鉴定阳性重组子pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9 | 第98页 |
| ·酶切筛选阳性重组子pET28a(+)-GDNF(ΔN39)-R9 | 第98页 |
| ·DNA自动测序与序列分析 | 第98-99页 |
| 2.GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白的表达、纯化、复性及定量 | 第99页 |
| 3.GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白生物学功能检测 | 第99-101页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白神经营养活性检测 | 第99-100页 |
| ·对原代培养中脑多巴胺能神经元的作用 | 第99-100页 |
| ·对PC12-GFRα1-Ret细胞突起生长的影响 | 第100页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9穿越细胞膜及血脑屏障模拟物能力检测 | 第100-101页 |
| ·GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白穿越脑血管内皮细胞膜能力检测 | 第100页 |
| ·Transwell检测GDNF(ΔN39)-R9穿越血脑屏障模拟物的能力 | 第100-101页 |
| 讨论 | 第101-105页 |
| 附图 | 第105-123页 |
| 参考文献 | 第123-135页 |
| 致谢 | 第135-136页 |
| 发表论文与专著 | 第136-137页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第137页 |
