| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-21页 |
| 第一章 综述 | 第21-59页 |
| 1. 乳酸乳球菌研究概况 | 第21-41页 |
| ·乳酸菌的分类 | 第21-22页 |
| ·乳酸菌作为黏膜输送载体的优势 | 第22-23页 |
| ·乳酸菌与宿主在黏膜表面的相互作用 | 第23-26页 |
| ·肠道黏膜结构与黏膜免疫 | 第23-24页 |
| ·分泌型IgA及其胞吞转运作用 | 第24-25页 |
| ·重组乳酸菌在肠道中的命运 | 第25-26页 |
| ·乳酸乳球菌表达系统的研究进展 | 第26-35页 |
| ·乳酸乳球菌表达系统 | 第27-33页 |
| ·Nisin 的结构特点 | 第27-28页 |
| ·Nisin 的生物合成 | 第28-29页 |
| ·Nisin控制的基因表达系统（NICE） | 第29-33页 |
| ·乳酸乳球菌细胞表面展示系统 | 第33-34页 |
| ·信号肽在乳酸乳球菌分泌表达中的作用 | 第34-35页 |
| ·乳酸乳球菌作为活疫苗输送载体的研究进展 | 第35-38页 |
| ·抗原和细胞因子的共表 | 第38页 |
| ·重组乳酸乳球菌用于治疗炎症性肠病的研究 | 第38-41页 |
| 2. 禽流感病毒简介 | 第41-43页 |
| 3. 流感大流行 | 第43-45页 |
| 4. 高致病性禽流感H5N1 病毒疫苗的研究进展 | 第45-56页 |
| ·全病毒灭活疫苗 | 第45-46页 |
| ·基于细胞培养为基础制备流感疫苗的研究 | 第46-47页 |
| ·减毒活疫苗 | 第47-48页 |
| ·反向遗传技术在流感疫苗开发中的应用 : | 第48-52页 |
| ·反向遗传技术在 H5N1 疫苗开发中的应用 | 第50-52页 |
| ·流感 DNA 疫苗 | 第52-53页 |
| ·以病毒为载体的流感疫苗 | 第53-54页 |
| ·通用流感疫苗 | 第54页 |
| ·流感黏膜疫苗 | 第54-55页 |
| ·人用禽流感疫苗的研究现状 | 第55-56页 |
| 5. 转基因植物疫苗 | 第56页 |
| 6. 研究目的与内容 | 第56-59页 |
| 第二章 分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定表达检测 | 第59-81页 |
| 1. 引言 | 第59-60页 |
| 2. 仪器、材料与方法 | 第60-75页 |
| ·仪器 | 第60页 |
| ·材料 | 第60-63页 |
| ·菌株和质粒 | 第60-61页 |
| ·主要试剂（盒） | 第61页 |
| ·细菌培养基及电泳缓冲液 | 第61-62页 |
| ·PCR 反应所需引物 | 第62-63页 |
| ·方法 | 第63-75页 |
| ·HA 基因的克隆 | 第63-65页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第63页 |
| ·pGEM-HA 的转化 | 第63-64页 |
| ·pGEM-HA 质粒的小量提取 | 第64-65页 |
| ·DNA 浓度测定 | 第65页 |
| ·HA 基因的 PCR 扩增 | 第65页 |
| ·PCR 产物的电泳分析及割胶回收 | 第65-67页 |
| ·电泳分析 PCR 产物 | 第65页 |
| ·割胶回收 | 第65-66页 |
| ·HA 基因的酶切分析、割胶回收 | 第66-67页 |
| ·PCR 产物酶切后的电泳分析及割胶回收 | 第67页 |
| ·非分泌型表达质粒 pNZ8150 和分泌型表达质粒 pNZ8100 的小量提 | 第67-70页 |
| ·Lactococcus lactis NZ9000 感受态细胞的的制备 | 第67-68页 |
| ·pNZ8150 与 pNZ8110 的电转 | 第68页 |
| ·pNZ8150 与 pNZ8110 的小量提取 | 第68-69页 |
| ·质粒 pNZ8110 与质粒 pNZ8150 的酶切反应 | 第69-70页 |
| ·质粒 pNZ8110 与质粒 pNZ8150 酶切后的电泳分析及割胶回收 | 第70页 |
| ·载体去磷酸反应 | 第70页 |
| ·连接反应 | 第70-71页 |
| ·纯化连接产物及电转至感受态 Lactococcus lactis NZ9000 | 第71页 |
| ·阳性克隆的筛选及鉴定 | 第71-72页 |
| ·质粒提取 | 第71页 |
| ·PCR 及酶切鉴定 | 第71-72页 |
| ·测序 | 第72页 |
| ·分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌的构建线路图 | 第72-75页 |
| 3. 结果 | 第75-79页 |
| ·HA 基因的 PCR 扩增结果 | 第75-76页 |
| ·分泌型表达质粒 pNZ8110 与非分泌型表达质粒 pNZ8150 的电泳分析 | 第76-77页 |
| ·重组乳酸乳球菌表达载体的酶切鉴定 | 第77-78页 |
| ·重组乳酸乳球菌表达载体的 PCR 鉴定 | 第78-79页 |
| 4. 讨论 | 第79-81页 |
| 第三章 表面展示型重组乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定 | 第81-94页 |
| 1. 引言 | 第81-82页 |
| 2. 仪器、材料与方法 | 第82-89页 |
| ·仪器 | 第82页 |
| ·方法 | 第82-83页 |
| ·菌种及细菌培养基 | 第82页 |
| ·PCR 反应所需引物 | 第82-83页 |
| ·方法 | 第83-87页 |
| ·pgsA 基因的克隆 | 第83-84页 |
| ·枯草芽孢杆菌基因组的提取 | 第83页 |
| ·pgsA 基因的 PCR 扩增 | 第83-84页 |
| ·pgsA 基因的电泳分析及割胶回收 | 第84页 |
| ·HA1 基因的克隆 | 第84页 |
| ·HA1 基因的电泳分析及割胶回收 | 第84-85页 |
| ·pgsA 基因与 HA1 基因的融合 | 第85页 |
| ·pgsA-HA1 基因的电泳分析及割胶回收 | 第85页 |
| ·pgsA-HA1 基因的酶切分析与割胶回收 | 第85-86页 |
| ·质粒 pNZ8110 的双酶切反应、割胶回收及去磷酸反应 | 第86页 |
| ·连接反应与电转化 | 第86-87页 |
| ·阳性克隆的筛选及鉴定 | 第87-88页 |
| ·质粒提取 | 第87页 |
| ·PCR 及酶切鉴定 | 第87页 |
| ·测序 | 第87-88页 |
| ·表面展示型重组乳酸乳球菌构建线路图 | 第88-89页 |
| 3. 结果 | 第89-92页 |
| ·pgsA 与 HA1 基因的 PCR 扩增结果 | 第89-90页 |
| ·桥式 PCR 反应及质粒 pNZ8110 的双酶切 | 第90-91页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第91-92页 |
| 4. 讨论 | 第92-94页 |
| 第四章 重组乳酸乳球菌的诱导表达及蛋白定位的鉴定 | 第94-109页 |
| 1. 引言 | 第94-95页 |
| 2. 仪器、材料与方法 | 第95-101页 |
| ·仪器 | 第95页 |
| ·材料 | 第95-96页 |
| ·方法 | 第96-101页 |
| ·重组乳酸乳球菌的诱导表达及生长曲线的测定 | 第96-97页 |
| ·表达产物的 SDS-PAGE 及 western blot 分析 | 第97-99页 |
| ·样品制备 | 第97页 |
| ·SDS-PAGE 胶的配制及电泳 | 第97-98页 |
| ·Western blot 分析 | 第98-99页 |
| ·流式细胞仪分析 | 第99页 |
| ·免疫荧光分析 | 第99-100页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第100-101页 |
| ·标准曲线的制备 | 第100页 |
| ·样品处理 | 第100页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第100-101页 |
| 3. 结果 | 第101-107页 |
| ·细菌生长曲线 | 第101-103页 |
| ·Western blot 分析 | 第103-104页 |
| ·流式细胞仪分析 | 第104-105页 |
| ·免疫荧光分析 | 第105-106页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第106-107页 |
| 4. 讨论 | 第107-109页 |
| 第五章 重组乳酸乳球菌联合佐剂后的免疫效果的评价 | 第109-132页 |
| 1. 前言 | 第109-111页 |
| 2. 仪器、材料与方法 | 第111-119页 |
| ·仪器 | 第111页 |
| ·材料 | 第111-113页 |
| ·方法 | 第113-118页 |
| ·免疫前的准备 | 第113-114页 |
| ·重组乳酸乳球菌的诱导表达 | 第113页 |
| ·免疫小鼠 | 第113-114页 |
| ·血清 IgG 的检测方法 | 第114-115页 |
| ·血清的采集及处理 | 第114页 |
| ·ELISA 检测血清 IgG | 第114-115页 |
| ·IgA 的检测 | 第115页 |
| ·小鼠粪便的采集 | 第115页 |
| ·间接 ELISA 检测 IgA | 第115页 |
| ·ELISpot 分析 | 第115-116页 |
| ·脾脏细胞的分离 | 第115-116页 |
| ·IFN-γ的检测 | 第116页 |
| ·血凝抑制（HI）实验 | 第116-118页 |
| ·受体破坏酶（RDE）处理血清 | 第116页 |
| ·去除非特异性凝集素 | 第116-117页 |
| ·4 个血凝单位抗原的调制 | 第117-118页 |
| ·标准抗原滴度的测定 | 第117页 |
| ·4个血凝单位的调制和复核 | 第117-118页 |
| ·HI 的检测步骤 | 第118页 |
| ·H5N1 病毒攻击实验 | 第118页 |
| ·统计学分析 | 第118-119页 |
| 3. 结果 | 第119-129页 |
| ·不同免疫剂量对血清 IgG 的影响 | 第119-122页 |
| ·不同免疫剂量对分泌型 IgA 的影响 | 第122-125页 |
| ·IFN-γ的检测 | 第125-126页 |
| ·血凝抑制（HI）实验 | 第126-127页 |
| ·H5N1 病毒攻击实验 | 第127-129页 |
| 4. 讨论 | 第129-132页 |
| 第六章 肠溶胶囊包裹的重组乳酸乳球菌免疫小鼠的研究 | 第132-147页 |
| 1. 引言 | 第132-133页 |
| 2. 仪器、材料与方法 | 第133-137页 |
| ·仪器 | 第133页 |
| ·材料 | 第133页 |
| ·方法 | 第133-136页 |
| ·肠溶胶囊在人工胃液中的耐酸性实验及在人工肠液中的崩解实验 | 第133页 |
| ·肠溶胶囊在小鼠体内的实验 | 第133-134页 |
| ·肠溶胶囊包裹重组乳酸乳球菌在体外的存活计数 | 第134页 |
| ·免疫前的准备 | 第134页 |
| ·重组乳酸乳球菌的诱导表达 | 第134页 |
| ·肠溶胶囊包裹重组乳酸乳球菌的制备 | 第134页 |
| ·免疫小鼠 | 第134-135页 |
| ·血清 IgG 的检测方法 | 第135页 |
| ·粪便 IgA 的检测 | 第135页 |
| ·ELISpot 分析 | 第135页 |
| ·血清 IgG 抗体的微量中和分析 | 第135-136页 |
| ·受体破坏酶（RDE）处理血清 | 第135页 |
| ·微量中和分析 | 第135-136页 |
| ·H5N1 病毒攻击实验 | 第136页 |
| ·统计学分析 | 第136-137页 |
| 3. 结果 | 第137-145页 |
| ·肠溶胶囊在人工胃肠液中的耐酸性实验与崩解实验 | 第137页 |
| ·重组乳酸乳球菌在模拟的人工胃肠环境中的相对数量 | 第137-138页 |
| ·肠溶胶囊包裹 Cy5.5 染料在小鼠体内的实验 | 第138-139页 |
| ·HA 特异性的血清 IgG 和粪便 IgA 的检测 | 第139-141页 |
| ·通过 ABS-ELISA 检测 HA 特异性的血清 IgG 抗体 | 第139-141页 |
| ·间接 ELISA 检测 HA 特异性的 IgA 抗体 | 第141页 |
| ·IFN-γ检测 | 第141-142页 |
| ·血清微量中和分析 | 第142-143页 |
| ·H5N1 病毒攻击实验 | 第143-145页 |
| 4. 讨论 | 第145-147页 |
| 第七章 总结与展望 | 第147-153页 |
| 参考文献 | 第153-173页 |
| 附录一 L.lactis(pNZ8110-HA)中的 HA 基因测序结果 | 第173-174页 |
| 附录二 L.lactis(pNZ8150-HA)中的 HA 基因测序结果 | 第174-175页 |
| 附录三 L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)中的pgsA-HA1 基因测序结果 | 第175-176页 |
| 致谢 | 第176-177页 |
| 攻读博士学位期间已发表或待发表论文情况 | 第177页 |
| 攻读博士学位期间发表会议论文情况 | 第177-179页 |
