| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 缩略词表 | 第5-6页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 第一章 引言 | 第10-23页 |
| ·MDCK细胞及其悬浮培养 | 第10-11页 |
| ·MDCK细胞 | 第10页 |
| ·MDCK细胞的悬浮培养 | 第10-11页 |
| ·禽流感受体及st3galI基因研究进展 | 第11-17页 |
| ·禽流感概述 | 第11-12页 |
| ·禽流感受体 | 第12-14页 |
| ·st3galI基因研究进展 | 第14-15页 |
| ·禽流感病毒感染和致病的分子机制 | 第15-17页 |
| ·siat7e基因概述 | 第17-19页 |
| ·MDCK细胞在禽流感疫苗生产上的应用与展望 | 第19-22页 |
| ·禽流感疫苗由鸡胚向细胞生产的转变 | 第19-20页 |
| ·MDCK细胞的优越性 | 第20-21页 |
| ·生产工艺研究 | 第21页 |
| ·展望 | 第21-22页 |
| ·研究目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 pReceiver-siat7e-st3galI重组真核表达载体的构建 | 第23-35页 |
| ·试验材料 | 第23-24页 |
| ·毒株、菌株、载体 | 第23页 |
| ·主要仪器 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-24页 |
| ·试验方法 | 第24-30页 |
| ·人和鸡血液样本RNA提取 | 第24-25页 |
| ·cDNA合成 | 第25页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·目的基因片段扩增 | 第25-26页 |
| ·pReceiver-siat7e载体构建 | 第26-29页 |
| ·pReceiver-siat7e-st3galI载体构建 | 第29-30页 |
| ·实验结果 | 第30-33页 |
| ·siat7e基因和st3galI基因的PCR扩增结果 | 第30-31页 |
| ·siat7e基因菌液PCR扩增结果 | 第31页 |
| ·pReceiver-siat7e重组质粒酶切鉴定结果 | 第31-32页 |
| ·st3galI基因菌液PCR扩增结果 | 第32页 |
| ·pReceiver-siat7e-st3galI重组载体基因酶切鉴定结果 | 第32-33页 |
| ·pReceiver-siat7e-st3galI重组载体PCR鉴定结果 | 第33页 |
| ·讨论 | 第33-34页 |
| ·小结 | 第34-35页 |
| 第三章 共表达siat7e和st3galI基因MDCK细胞株的建立 | 第35-44页 |
| ·试验材料 | 第35-36页 |
| ·细胞及载体 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35-36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·方法 | 第36-39页 |
| ·MDCK细胞复苏 | 第36页 |
| ·确定筛选培养基中合适的G418浓度 | 第36页 |
| ·最佳电击转染条件的确定 | 第36-37页 |
| ·重组质粒的准备及浓度测定 | 第37页 |
| ·细胞转染与克隆 | 第37页 |
| ·阳性单细胞克隆鉴定 | 第37-39页 |
| ·MDCK-C5细胞株遗传稳定性检测 | 第39页 |
| ·试验结果 | 第39-42页 |
| ·MDCK细胞培养中G418浓度的筛选结果 | 第39-40页 |
| ·不同电击条件筛选结果 | 第40页 |
| ·荧光观察结果 | 第40-41页 |
| ·阳性细胞克隆基因组鉴定结果 | 第41页 |
| ·阳性细胞克隆RT-PCR鉴定结果 | 第41-42页 |
| ·MDCK-C5细胞株遗传稳定性检测结果 | 第42页 |
| ·讨论 | 第42-43页 |
| ·小结 | 第43-44页 |
| 第四章 siat7e和st3galI双基因高表达细胞株的筛选 | 第44-54页 |
| ·试验材料 | 第44-45页 |
| ·细胞 | 第44页 |
| ·主要试剂 | 第44页 |
| ·主要仪器 | 第44-45页 |
| ·方法 | 第45-47页 |
| ·TqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立 | 第45-46页 |
| ·荧光定量PCR筛选 | 第46页 |
| ·流式细胞术筛选 | 第46-47页 |
| ·结果与分析 | 第47-52页 |
| ·pGEM-GAPDH标准质粒鉴定结果 | 第47页 |
| ·TaqMan探针荧光定量PCR标准曲线构建 | 第47-48页 |
| ·敏感性试验 | 第48-49页 |
| ·重复性试验 | 第49-51页 |
| ·相对荧光定量筛选结果 | 第51页 |
| ·流式筛选结果 | 第51-52页 |
| ·讨论 | 第52-53页 |
| ·小结 | 第53-54页 |
| 第五章 MDCK-C5细胞株的悬浮驯化及H9N2 A株C5禽流感病毒在其增殖特性研究 | 第54-61页 |
| ·试验材料 | 第54-55页 |
| ·毒株与细胞 | 第54页 |
| ·主要材料试剂 | 第54页 |
| ·主要仪器 | 第54-55页 |
| ·试验方法 | 第55-57页 |
| ·H9N2 A株C5代毒TCID5o的测定 | 第55页 |
| ·1%鸡红细胞悬液的配制 | 第55页 |
| ·禽流感H9N2 A株C5代病毒在MDCK细胞系和MDCK-C5细胞株增殖比较 | 第55-56页 |
| ·MDCK-C5细胞株的悬浮驯化 | 第56页 |
| ·细胞悬浮生长曲线的绘制 | 第56页 |
| ·H9N2 A株C5代毒接种MDCK-C5悬浮细胞株 | 第56页 |
| ·病毒含量EID_(50)的测定 | 第56-57页 |
| ·结果 | 第57-59页 |
| ·H9N2 A株C5代毒TCID_(50)的测定 | 第57页 |
| ·禽流感H9N2 A株C5代毒在MDCK细胞系和MDCK-C5细胞株HA测定结果 | 第57页 |
| ·不同时段细胞观察 | 第57-58页 |
| ·细胞悬浮生长曲线 | 第58页 |
| ·禽流感H9N2 A株C5代在悬浮MDCK-C5细胞株HA的测定结果 | 第58页 |
| ·禽流感H9N2 A株C5代在悬浮MDCK-C5细胞株EID_(50)的测定结果 | 第58-59页 |
| ·讨论 | 第59-60页 |
| ·小结 | 第60-61页 |
| 第六章 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-70页 |
| 附录 | 第70-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 作者简历 | 第76页 |
