| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-33页 |
| ·RNAi研究概述 | 第12-28页 |
| ·RNAi作用机制 | 第12-15页 |
| ·RNAi的生物学意义 | 第15-16页 |
| ·RNAi的应用 | 第16-19页 |
| ·RNAi技术进展 | 第19-27页 |
| ·RNAi文库简介 | 第27-28页 |
| ·慢病毒及慢病毒介导的RNAi简介 | 第28-31页 |
| ·慢病毒 | 第28-29页 |
| ·慢病毒载体介导的RNAi | 第29-31页 |
| ·本研究的的目的 | 第31-33页 |
| 第二部分 材料和方法 | 第33-47页 |
| ·材料 | 第33-38页 |
| ·菌株和质粒 | 第33-34页 |
| ·细胞系 | 第34页 |
| ·培养基配方及配制 | 第34-35页 |
| ·主要引物 | 第35-36页 |
| ·主要试剂 | 第36-37页 |
| ·主要缓冲液 | 第37-38页 |
| ·仪器和设备 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-47页 |
| ·SDS碱裂解法制备质粒DNA(小量制备) | 第38-39页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第39-40页 |
| ·PCR反应体系 | 第40页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第40-41页 |
| ·哺乳动物细胞的冻存和复苏 | 第41-42页 |
| ·哺乳动物细胞HEK293FT、HEK 293T、Hela等细胞系的传代培养 | 第42页 |
| ·RT-PCR检测目的基因mRNA的表达量 | 第42-44页 |
| ·蛋白质印记(Western blot)检测目的基因蛋白质的表达量 | 第44-45页 |
| ·质粒DNA转染哺乳动物细胞 | 第45页 |
| ·慢病毒包装简要程序 | 第45页 |
| ·慢病毒滴度的测定 | 第45-47页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第47-68页 |
| ·LIC法构建shRNA重组质粒载体的策略 | 第47-57页 |
| ·shRNA重组质粒载体的构建和鉴定 | 第47-55页 |
| ·用于表达shRNA的质粒载体的构建 | 第47-51页 |
| ·shRNA重组质粒载体的构建 | 第51-54页 |
| ·shRNA重组质粒载体的克隆效率与测序结果 | 第54-55页 |
| ·shRNA重组质粒载体干扰效果的检测 | 第55-57页 |
| ·在mRNA水平上检测shRNA重组质粒载体的干扰效果 | 第55-56页 |
| ·在蛋白表达水平上检测shRNA重组质粒载体的干扰效果 | 第56-57页 |
| ·LIC法构建shRNA慢病毒表达载体策略 | 第57-68页 |
| ·shRNA重组慢病毒载体的构建和鉴定 | 第57-65页 |
| ·用于表达shRNA的慢病毒载体的构建 | 第57-62页 |
| ·重组shRNA慢病毒载体的构建 | 第62-63页 |
| ·shRNA重组慢病毒载体的克隆效率及测序结果 | 第63-65页 |
| ·重组慢病毒的包装和感染 | 第65-68页 |
| ·重组慢病毒的包装 | 第65-66页 |
| ·重组慢病毒的感染 | 第66-68页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第68-72页 |
| ·讨论 | 第68-71页 |
| ·本研究LIC克隆方法的原理 | 第68-69页 |
| ·该方法克隆操作简单 | 第69页 |
| ·该方法克隆效率高 | 第69-70页 |
| ·该方法测序突变率低 | 第70页 |
| ·该方法重组子筛选方式简便 | 第70页 |
| ·该方法构建的干扰载体实用 | 第70-71页 |
| ·展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-75页 |
| 附录：攻读学位期间获得的研究成果 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
