| 第一部分:扩张型心肌病致病基因LMNA突变功能研究 | 第1-44页 |
| 中文摘要 | 第6-7页 |
| 英文摘要 | 第7-9页 |
| 前言 | 第9-10页 |
| 材料和方法 | 第10-33页 |
| 1.主要仪器设备 | 第10-11页 |
| 2.主要试剂 | 第11页 |
| 3.研究对象 | 第11-12页 |
| 4.实验方法 | 第12-33页 |
| ·突变筛查 | 第12页 |
| ·感受态细菌制备 | 第12-13页 |
| ·热休克法转化大肠杆菌 | 第13页 |
| ·小量质粒提取 | 第13-14页 |
| ·限制性内切酶酶切反应 | 第14页 |
| ·切胶回收DNA片断 | 第14-15页 |
| ·连接反应 | 第15页 |
| ·LMNA Glu82Lys突变体制备 | 第15-17页 |
| ·人胎心总RNA提取 | 第17-18页 |
| ·逆转录制备人胎心cDNA | 第18页 |
| ·Emerin 基因cDNA克隆与转染载体构建 | 第18-20页 |
| ·转染用无内毒素质粒大量制备 | 第20-22页 |
| ·HEK293细胞复苏、培养与冻存 | 第22-23页 |
| ·HEK293细胞瞬时转染 | 第23-24页 |
| ·稳定转染HEK293细胞株筛选 | 第24页 |
| ·细胞总蛋白提取 | 第24-25页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第25-26页 |
| ·制作标准曲线 | 第25页 |
| ·检测样品蛋白含量 | 第25-26页 |
| ·Western-blot分析 | 第26-28页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第26-27页 |
| ·转膜实验 | 第27-28页 |
| ·免疫反应及显色 | 第28-29页 |
| ·苏木精—伊红染色 | 第29-30页 |
| ·过氧化氢诱导细胞凋亡 | 第30页 |
| ·Hochest33342染色 | 第30页 |
| ·透射电镜实验 | 第30-32页 |
| ·免疫荧光染色 | 第32页 |
| ·统计学分析 | 第32-33页 |
| 结果 | 第33-40页 |
| 1.家系及先证者资料 | 第33页 |
| 2.LMNA基因测序分析 | 第33-34页 |
| 3.LMNA基因野生及Glu82Lys突变体转染载体构建 | 第34-35页 |
| 4.LMNA基因野生型、突变体及空载体稳定转染细胞株筛选 | 第35-36页 |
| 5.Glu82Lys突变对lamin A蛋白对细胞核核膜结构的影响 | 第36页 |
| 6.LMNA基因Glu82Lys突变促进细胞凋亡 | 第36-37页 |
| 7.瞬时转染LMNA基因后蛋白表达的测定 | 第37-38页 |
| 8.Emerin基因克隆及转染载体构建 | 第38页 |
| 9.Glu82Lys突变影响lamin A和emerin蛋白细胞定位 | 第38-40页 |
| 讨论 | 第40-44页 |
| 第二部分:心脏特异基因TNNI3K调控机制研究 | 第44-82页 |
| 中文摘要 | 第44-45页 |
| 英文摘要 | 第45-46页 |
| 前言 | 第46-47页 |
| 材料和方法 | 第47-73页 |
| 1.主要试剂 | 第47-48页 |
| 2.实验方法 | 第48-73页 |
| ·生物信息学分析 | 第48页 |
| ·总RNA提取 | 第48-49页 |
| ·RT-PCR反应 | 第49-51页 |
| ·逆转录反应 | 第49-50页 |
| ·PCR扩增反应 | 第50-51页 |
| ·将PCR产物克隆到pGEM-T easy载体 | 第51-52页 |
| ·切胶回收目的条带 | 第51页 |
| ·将纯化的片段克隆到pGEM-T easy载体 | 第51-52页 |
| ·转化连接产物 | 第52页 |
| ·碱裂解法提取质粒DNA | 第52-53页 |
| ·’RACE实验确定转录起始位点 | 第53-56页 |
| ·RT-PCR检测表达谱 | 第56-57页 |
| ·小鼠鼠尾基因组DNA的提取 | 第57页 |
| ·同源比对预洲小鼠CARK基因保守启动子区 | 第57-59页 |
| ·小鼠CARK基因删节启动子区荧光素酶报告载体的构建 | 第59-64页 |
| ·核心启动子区转录因子结合位点预测及点突变质粒的构建 | 第64-66页 |
| ·大量提取无内毒素质粒DNA | 第66-67页 |
| ·原代心肌细胞培养 | 第67页 |
| ·心肌细胞转染 | 第67-68页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第68页 |
| ·心肌细胞核蛋白提取 | 第68-69页 |
| ·探针3’末端生物素标记 | 第69-70页 |
| ·凝胶迁移及超迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay) | 第70-72页 |
| ·配制6%非变性聚丙烯酰胺凝胶 | 第70-71页 |
| ·探针与蛋白结合反应 | 第71页 |
| ·电转膜及交联 | 第71页 |
| ·化学发光显色 | 第71-72页 |
| ·Mef2c morpholino反义核酸干扰实验 | 第72-73页 |
| ·Western-blot分析 | 第73页 |
| ·统计学分析 | 第73页 |
| 结果 | 第73-82页 |
| 1.小鼠CARK基因的克隆与鉴定 | 第73-75页 |
| 2.小鼠CARK基因组织表达谱 | 第75页 |
| 3.确定小鼠CARK基因的转录起始位点 | 第75-77页 |
| 4.删节实验确定小鼠CARK基因核心启动子区 | 第77-78页 |
| 5.核心启动子区心脏特异转录因子结合位点突变活性分析 | 第78-81页 |
| 6.mef2c转录因子可以与MEF2位点结合 | 第81页 |
| 7.抑制mef2c蛋白的表达可以降低CARK基因的转录活性 | 第81-82页 |
| 讨论 | 第82-85页 |
| 参考文献 | 第85-91页 |
| 综述一:基因突变与扩张型心肌病 | 第91-97页 |
| 参考文献 | 第95-97页 |
| 综述二:扩张型心肌病致病基因LMNA研究进展 | 第97-109页 |
| 参考文献 | 第105-109页 |
| 缩略语表 | 第109-111页 |
| 个人简历 | 第111-114页 |
| 致谢 | 第114页 |
