| 摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-20页 |
| 缩略词表 | 第20-21页 |
| 引言 | 第21-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第23-47页 |
| 1 植物抗病机制 | 第23-24页 |
| 2 植物系统获得抗病性研究进展 | 第24-40页 |
| ·信号转导途径 | 第24-26页 |
| ·依赖水杨酸(SA)的信号转导 | 第24-25页 |
| ·依赖茉莉酸/乙烯(JA/ET)的信号转导 | 第25页 |
| ·SA信号转导途径和JA/ET的信号转导途径的互作 | 第25-26页 |
| ·植物病程相关蛋白非表达子(NPR1)基因 | 第26-29页 |
| ·植物NPR1基因的克隆 | 第26-27页 |
| ·NPR1基因的结构 | 第27页 |
| ·NPR1蛋白的功能 | 第27-28页 |
| ·NPR1基因的作用机理 | 第28-29页 |
| ·碱性亮氨酸拉链(bZIP)类转录因子 | 第29-38页 |
| ·bZIP转录因子的分布、结构与亚细胞定位 | 第30-31页 |
| ·植物bZIP转录因子的分类 | 第31页 |
| ·植物bZIP转录因子的功能 | 第31-37页 |
| ·TGA类转录因子 | 第37-38页 |
| ·病程相关蛋白基因 | 第38-40页 |
| ·病程相关蛋白基因的分类 | 第38-39页 |
| ·病程相关蛋白的功能 | 第39-40页 |
| 3 基因克隆技术研究进展 | 第40-43页 |
| ·图位克隆 | 第41页 |
| ·RACE | 第41-42页 |
| ·cDNA文库筛选技术 | 第42页 |
| ·转座子标签 | 第42页 |
| ·电子克隆 | 第42-43页 |
| 4 植物多基因转化的方法 | 第43-46页 |
| 5 本研究的技术路线图 | 第46-47页 |
| 第二章 水杨酸处理湖北海棠全长cDNA文库的构建 | 第47-61页 |
| 1 材料与方法 | 第48-52页 |
| ·植物材料与处理 | 第48页 |
| ·仪器和药品 | 第48页 |
| ·仪器 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48页 |
| ·全长cDNA文库的构建 | 第48-52页 |
| ·总RNA的提取 | 第48-49页 |
| ·mRNA的纯化 | 第49-50页 |
| ·全长cDNA文库的构建 | 第50页 |
| ·cDNA文库中片段大小的检测 | 第50页 |
| ·湖北海棠MhPGIP基因的克隆 | 第50-51页 |
| ·湖北海棠MhWRKY1基因克隆 | 第51页 |
| ·目的片段的回收及克隆 | 第51-52页 |
| ·湖北海棠MhPGIP基因和MhWRKY转录因子的序列分析 | 第52页 |
| 2 结果与分析 | 第52-58页 |
| ·苹果叶片总RNA的浓度与质量分析 | 第52-53页 |
| ·mRNA的纯化 | 第53页 |
| ·dscDNA的合成 | 第53-54页 |
| ·dscDNA中片段大小的测定 | 第54页 |
| ·湖北海棠MhPGIP基因的克隆和序列分析 | 第54-55页 |
| ·湖北海棠MhWRKY1转录因子的克隆与序列分析 | 第55-58页 |
| ·湖北海棠MhWRKY1转录因子全长cDNA序列的电子克隆及其RT-PCR验证 | 第55-56页 |
| ·湖北海棠MhWRKY1转录因子基因全长cDNA序列分析 | 第56-58页 |
| 3 讨论 | 第58-61页 |
| 第三章 湖北海棠MhNPR1基因的克隆与功能分析 | 第61-103页 |
| 第一节 湖北海棠MhNPR1基因及其上游启动子的克隆与序列分析 | 第61-73页 |
| 1 材料和方法 | 第62-66页 |
| ·植物材料 | 第62页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第62页 |
| ·湖北海棠MhNPR1基因的克隆 | 第62-64页 |
| ·湖北海棠MhNPR1基因cDNA克隆 | 第62-63页 |
| ·湖北海棠基因组MhNPR1基因ORF的扩增 | 第63-64页 |
| ·目的片段的回收及克隆 | 第64页 |
| ·MhNPR1上游启动子序列的克隆 | 第64-66页 |
| ·MhNPR1基因上游调控区染色体步行的接头序列 | 第64页 |
| ·接头引物 | 第64页 |
| ·MhNPR1基因特异性引物 | 第64页 |
| ·启动子的克隆 | 第64-66页 |
| ·MhNPR1启动子PCR产物回收、克隆及测序 | 第66页 |
| ·序列分析 | 第66页 |
| ·细胞定位分析 | 第66页 |
| 2 结果与分析 | 第66-72页 |
| ·湖北海棠NPR1基因的cDNA克隆与基因组DNA克隆 | 第66-67页 |
| ·MhNPR1氨基酸序列分析 | 第67-69页 |
| ·MhNPR1基因上游启动子序列的分离 | 第69-70页 |
| ·MhNPR1基因上游启动子序列顺式作用元件分析 | 第70-71页 |
| ·MhNPR1的亚细胞定位分析 | 第71-72页 |
| 3 讨论 | 第72-73页 |
| 第二节 湖北海棠MhNPR1基因表达特性的研究 | 第73-82页 |
| 1 材料和方法 | 第73-76页 |
| ·材料与处理 | 第73-74页 |
| ·试剂和仪器 | 第74页 |
| ·方法 | 第74-76页 |
| ·总RNA的提取 | 第74页 |
| ·总RNA中DNA的消化以及cDNA第一链的合成 | 第74-75页 |
| ·荧光定量PCR分析 | 第75-76页 |
| 2 结果与分析 | 第76-80页 |
| ·湖北海棠叶片、茎、根总RNA的提取 | 第76页 |
| ·MhNPR1基因在各组织中的表达特性分析 | 第76-77页 |
| ·SA、MeJA、ACC诱导MhNPR1基因的在叶片中的表达分析 | 第77页 |
| ·SA、MeJA、ACC诱导MhNPR1基因的在茎中的表达分析 | 第77-78页 |
| ·SA、MeJA、ACC诱导MhNPR1基因的在根中的表达分析 | 第78-79页 |
| ·苹果轮纹病病原菌诱导MhNPR1基因的在叶片中的表达分析 | 第79页 |
| ·苹果蚜虫诱导MhNPR1基因的在叶片、茎中的表达分析 | 第79-80页 |
| 3 讨论 | 第80-82页 |
| 第三节 湖北海棠MhNPR1基因的功能分析 | 第82-103页 |
| 1 材料和方法 | 第82-89页 |
| ·材料 | 第82-83页 |
| ·植物材料 | 第82页 |
| ·质粒与菌株 | 第82-83页 |
| ·试剂与仪器 | 第83页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第83-84页 |
| ·带有酶切位点的MhNPR1基因的克隆 | 第83-84页 |
| ·载体构建 | 第84页 |
| ·转基因烟草株系的获得 | 第84-85页 |
| ·遗传转化 | 第84页 |
| ·转基因烟草株系的检测 | 第84-85页 |
| ·转基因烟草病程相关蛋白基因的表达分析 | 第85-87页 |
| ·转基因烟草抗病性分析 | 第87页 |
| ·烟草灰霉病病原菌的培养 | 第87页 |
| ·转基因烟草抗病性分析 | 第87页 |
| ·转基因烟草抗渗透胁迫分析 | 第87-88页 |
| ·T_0株系叶盘法分析 | 第87页 |
| ·T_1代种子发芽试验 | 第87-88页 |
| ·T_1代植株苗期分析 | 第88页 |
| ·转基因烟草抗盐性分析 | 第88页 |
| ·T_1代种子发芽试验 | 第88页 |
| ·T_1代幼苗组培苗抗盐性分析 | 第88页 |
| ·T_1代幼苗大田抗盐性分析 | 第88页 |
| ·转基因烟草抗性相关基因的半定量RT-PCR分析 | 第88-89页 |
| 2 结果与分析 | 第89-101页 |
| ·湖北海棠MhNPR1基因双元表达载体的构建 | 第89-90页 |
| ·转基因烟草株系获得 | 第90-91页 |
| ·PCR检测 | 第90-91页 |
| ·RT-PCR检测 | 第91页 |
| ·过量表达MhNPR1基因诱导烟草PR基因的表达 | 第91-92页 |
| ·转基因烟草的抗病性分析 | 第92-93页 |
| ·转基因烟草的抗旱性分析 | 第93-97页 |
| ·转基因烟草的抗盐性分析 | 第97-100页 |
| ·转基因烟草株系抗逆相关基因的表达分析 | 第100-101页 |
| 3 讨论 | 第101-103页 |
| 第四章 湖北海棠MhTGA2基因的克隆与功能分析 | 第103-123页 |
| 第一节 湖北海棠MhTGA2基因的克隆与序列分析 | 第103-114页 |
| 1 材料与方法 | 第104-106页 |
| ·材料 | 第104页 |
| ·试剂与仪器 | 第104页 |
| ·方法 | 第104-106页 |
| ·湖北海棠MhTGA2保守片段的克隆 | 第104-105页 |
| ·湖北海棠MhTGA2 3’端的扩增(3’RACE) | 第105页 |
| ·MhTGA2 5’电子克隆 | 第105-106页 |
| ·MhTGA2基因ORF的扩增 | 第106页 |
| ·湖北海棠MhTGA2基因的序列分析 | 第106页 |
| ·细胞定位分析 | 第106页 |
| 2 结果与分析 | 第106-112页 |
| ·湖北海棠MhTGA2基因中间片段的获得 | 第106-107页 |
| ·湖北海棠MhTGA2基因3’序列和5’序列的获得 | 第107页 |
| ·湖北海棠MhTGA2基因的序列全长序列 | 第107-108页 |
| ·湖北海棠MhTGA2基因同源性比较 | 第108-111页 |
| ·亚细胞定位分析 | 第111-112页 |
| 3 讨论 | 第112-114页 |
| 第二节 湖北海棠MhTGA2基因的表达与功能分析 | 第114-123页 |
| 1 材料与方法 | 第115-116页 |
| ·植物材料与处理 | 第115页 |
| ·方法 | 第115-116页 |
| ·表达特性的分析 | 第115-116页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第116页 |
| ·转基因烟草株系的获得 | 第116页 |
| ·转基因烟草株系中抗逆相关基因的表达分析 | 第116页 |
| 2 结果与分析 | 第116-120页 |
| ·湖北海棠MhTGA2在组织中的表达特性 | 第116-117页 |
| ·湖北海棠MhTGA2受SA、MeJA、ACC诱导表达 | 第117页 |
| ·苹果轮纹病病原菌处理后的湖北海棠MhTGA2基因的表达分析 | 第117-118页 |
| ·湖北海棠MhTGA2基因植物表达载体的构建 | 第118页 |
| ·转基因烟草株系的获得 | 第118-119页 |
| ·PCR检测 | 第118-119页 |
| ·RT-PCR检测 | 第119页 |
| ·转基因烟草株系中PR基因的表达分析 | 第119-120页 |
| ·转基因烟草中抗逆相关基因的表达分析 | 第120页 |
| 3 讨论 | 第120-123页 |
| 第五章 湖北海棠病程相关蛋白基因的克隆与功能分析 | 第123-157页 |
| 第一节 湖北海棠几丁质酶基因(Mhchit1)的克隆与功能分析 | 第123-137页 |
| 1 材料和方法 | 第124-127页 |
| ·电子克隆 | 第124页 |
| ·植物材料与处理 | 第124页 |
| ·植物材料 | 第124页 |
| ·材料处理 | 第124页 |
| ·湖北海棠Mhchit1的全编码区的验证 | 第124-125页 |
| ·湖北海棠Mhchit1基因的基因组DNA扩增 | 第125页 |
| ·序列分析 | 第125页 |
| ·细胞定位 | 第125页 |
| ·植物表达载体的构建及其转化烟草的研究 | 第125页 |
| ·转基因烟草植株的获得 | 第125页 |
| ·基因表达分析 | 第125-126页 |
| ·湖北海棠内源Mhchit1基因的表达分析 | 第125页 |
| ·转Mhchit1基因烟草中抗逆相关基因的表达分析 | 第125-126页 |
| ·转基因烟草的抗病性实验 | 第126-127页 |
| ·转基因烟草株系抗渗透胁迫分析 | 第127页 |
| 2 结果与分析 | 第127-135页 |
| ·湖北海棠MhChit1基因的克隆 | 第127页 |
| ·湖北海棠Mhchit1基因推导的氨基酸序列的分析 | 第127-129页 |
| ·湖北海棠几丁质酶的表达特性分析 | 第129-131页 |
| ·湖北海棠几丁质酶基因在根茎叶中的表达特性 | 第129页 |
| ·湖北海棠几丁质酶可以被植物激素SA、MeJA和ACC诱导表达 | 第129-131页 |
| ·苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠Mhchit1基因的表达 | 第131页 |
| ·苹果蚜虫诱导Mhchit1基因的表达 | 第131页 |
| ·湖北海棠M-hchit1蛋白的亚细胞定位分析 | 第131-132页 |
| ·转Mhchit1基因烟草株系的获得 | 第132-133页 |
| ·抗逆相关基因的表达分析 | 第133-134页 |
| ·转基因烟草抗烟草灰霉病病原菌能力分析 | 第134页 |
| ·转基因烟草对渗透胁迫的抗性 | 第134-135页 |
| 3 讨论 | 第135-137页 |
| 第二节 湖北海棠B-1,3-葡聚糖酶基因(MhGlu)的克隆与表达分析 | 第137-145页 |
| 1 材料和方法 | 第138-139页 |
| ·电子克隆 | 第138页 |
| ·植物材料与处理 | 第138页 |
| ·总RNA的提取 | 第138页 |
| ·湖北海棠β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的RT-PCR扩增 | 第138-139页 |
| ·湖北海棠β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的基因组PCR扩增 | 第139页 |
| ·基因组步移 | 第139页 |
| ·序列分析 | 第139页 |
| ·荧光定量RT-PCR | 第139页 |
| 2 结果与分析 | 第139-143页 |
| ·MhGLu基因的克隆 | 第139-140页 |
| ·序列比对 | 第140页 |
| ·MhGLu上游启动子序列的分离和cis-元件分析 | 第140-141页 |
| ·MhGlu在不同组织中的表达特性 | 第141页 |
| ·MhGLu受SA、MeJA、和ACC诱导表达 | 第141-142页 |
| ·苹果轮纹病病原菌诱导MhGLu基因的表达 | 第142-143页 |
| ·苹果蚜虫诱导湖北海棠MhGlu基因的表达 | 第143页 |
| 3 讨论 | 第143-145页 |
| 第三节 湖北海棠MhPR1、MhPR5基因的克隆与表达分析 | 第145-157页 |
| 1 材料和方法 | 第146-147页 |
| ·材料 | 第146页 |
| ·方法 | 第146-147页 |
| ·MhPR1、MhPR5基因cDNA克隆 | 第146页 |
| ·MhPR1、MhPR5基因的基因组DNA克隆 | 第146页 |
| ·序列分析 | 第146页 |
| ·荧光定量RT-PCR分析 | 第146-147页 |
| 2 结果与分析 | 第147-154页 |
| ·湖北海棠MhPR1基因的克隆及其序列分析 | 第147-149页 |
| ·湖北海棠MhPR5基因的克隆及其序列分析 | 第149-151页 |
| ·湖北海棠MhPR1和MhPR5基因在叶、茎和根中的表达特性 | 第151页 |
| ·湖北海棠MhPR1基因受SA、MeJA、ACC诱导表达 | 第151-154页 |
| ·湖北海棠MhPR5基因受SA、MeJA、ACC诱导表达 | 第154页 |
| 3 讨论 | 第154-157页 |
| 第六章 湖北海棠三价融合表达载体(Mh TNC)的构建及其功能分析 | 第157-177页 |
| 1 材料和方法 | 第158-163页 |
| ·材料 | 第158页 |
| ·试剂和仪器 | 第158-159页 |
| ·试剂 | 第158页 |
| ·仪器 | 第158-159页 |
| ·方法 | 第159-163页 |
| ·引物合成 | 第159页 |
| ·湖北海棠MhTGA2、MhNPR1和Mhchit1三个目的基因的扩增 | 第159-160页 |
| ·植物融合表达载体的改造 | 第160页 |
| ·中间载体的构建 | 第160-161页 |
| ·植物三价双元表达载体的构建 | 第161页 |
| ·遗传转化 | 第161页 |
| ·将潮霉素抗性烟草株系进行PCR和RT-PCR检测 | 第161-163页 |
| ·三价融合基因的功能分析 | 第163页 |
| ·转三价融合基因烟草的表型观察 | 第163页 |
| ·转三价融合基因烟草的抗病性分析 | 第163页 |
| ·转三价基因的抗旱性分析 | 第163页 |
| 2 结果与分析 | 第163-175页 |
| ·三价融合表达载体的构建 | 第163-168页 |
| ·植物表达载体的改造 | 第163-164页 |
| ·三个基因的扩增及其酶切 | 第164页 |
| ·中间表达载体的构建 | 第164-165页 |
| ·植物三价融合表达载体的构建 | 第165-168页 |
| ·转基因烟草株系的获得 | 第168-169页 |
| ·转基因烟草抗性株系的PCR检测 | 第168-169页 |
| ·转基因烟草株系的RT-PCR检测 | 第169页 |
| ·转基因烟草株系的表型观察 | 第169-172页 |
| ·转3价载体烟草提前开花 | 第169-171页 |
| ·转3价载体烟草矮化、节数减少、节间增长 | 第171-172页 |
| ·转基因烟草株系抗性相关酶基因的定量PCR分析 | 第172-173页 |
| ·转基因烟草株系的抗灰霉病菌分析 | 第173页 |
| ·转基因烟草株系的抗PEG6000分析 | 第173-175页 |
| 3 讨论 | 第175-177页 |
| 参考文献 | 第177-199页 |
| 主要创新点 | 第199-201页 |
| 攻读博士期间发表的学术论文和申请的专利 | 第201-203页 |
| 致谢 | 第203页 |
