戴尔根霉脂肪酶基因的克隆与表达
| 第一章 绪论 | 第1-25页 |
| ·脂肪酶简介 | 第11-13页 |
| ·脂肪酶的结构与催化机理 | 第11-12页 |
| ·微生物脂肪酶的水解特异性 | 第12-13页 |
| ·位置特异性 | 第12页 |
| ·脂肪酸特异性 | 第12页 |
| ·立体特异性 | 第12-13页 |
| ·微生物脂肪酶的生产 | 第13-15页 |
| ·脂肪酶的应用 | 第15-18页 |
| ·生产单甘酯 | 第15-16页 |
| ·食品工业 | 第16页 |
| ·医药 | 第16-17页 |
| ·皮革生产 | 第17页 |
| ·纸浆和造纸 | 第17页 |
| ·手性化合物的制备 | 第17-18页 |
| ·洗涤剂 | 第18页 |
| ·脂肪酶的分子生物学研究 | 第18-21页 |
| ·细菌脂肪酶 | 第18-19页 |
| ·真菌脂肪酶 | 第19-21页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第21-23页 |
| ·小结 | 第23-25页 |
| 第二章 戴尔根霉脂肪酶基因的克隆 | 第25-43页 |
| ·引言 | 第25页 |
| ·实验仪器与材料 | 第25-27页 |
| ·实验仪器 | 第25-26页 |
| ·载体与菌株 | 第26页 |
| ·酶及主要药品 | 第26页 |
| ·溶液配制 | 第26-27页 |
| ·提取基因组DNA缓冲液 | 第26-27页 |
| ·提取质粒DNA缓冲液 | 第27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·实验方法 | 第27-35页 |
| ·戴尔根霉总DNA的提取 | 第27-28页 |
| ·紫外光谱分析法测定DNA纯度 | 第28页 |
| ·PCR扩增戴尔根霉脂肪酶基因 | 第28-30页 |
| ·引物的设计 | 第28-29页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第29-30页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第30页 |
| ·重组质粒pUCmT-LipRD的构建 | 第30-33页 |
| ·目的基因LipRD与pUCm-T载体的连接 | 第31页 |
| ·CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第31-32页 |
| ·重组质粒pUCmT-LipRD的转化 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的初步鉴定 | 第33-35页 |
| ·菌落PCR初步鉴定重组子 | 第33页 |
| ·碱裂解法小规模抽提质粒DNA | 第33-34页 |
| ·重组质粒pUCmT-LipRD双酶切鉴定 | 第34-35页 |
| ·LipRD基因测序 | 第35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-41页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第35-36页 |
| ·基因组DNA的纯度 | 第36页 |
| ·脂肪酶基因PCR扩增结果 | 第36-37页 |
| ·阳性转化子的鉴定 | 第37-38页 |
| ·重组质粒基因序列测定 | 第38-41页 |
| ·小结 | 第41-43页 |
| 第三章 戴尔根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第43-57页 |
| ·引言 | 第43页 |
| ·实验仪器与材料 | 第43-44页 |
| ·实验仪器 | 第43页 |
| ·试剂 | 第43页 |
| ·质粒与菌株 | 第43-44页 |
| ·溶液和培养基 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-52页 |
| ·毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| ·酵母电击转化 | 第46页 |
| ·重组子的筛选 | 第46-47页 |
| ·His~+Mut~+阳性克隆的筛选 | 第46页 |
| ·G418筛选高拷贝转化子 | 第46-47页 |
| ·三丁酸甘油酯平板活性筛选高表达转化子 | 第47页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第47-48页 |
| ·毕赤酵母基因组DNA的提取 | 第47-48页 |
| ·PCR检测转化子 | 第48页 |
| ·甲醇诱导脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第48页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第48-51页 |
| ·SDS-PAGE电泳胶的制备 | 第49-50页 |
| ·上样电泳 | 第50页 |
| ·凝胶的染色、脱色 | 第50-51页 |
| ·表达产物酶活的测定 | 第51-52页 |
| ·结果与讨论 | 第52-55页 |
| ·毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第52页 |
| ·酵母重组子的筛选和鉴定 | 第52-53页 |
| ·PCR检测转化子 | 第53-54页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第54页 |
| ·表达产物活性测定 | 第54-55页 |
| ·小结 | 第55-57页 |
| 第四章 重组菌诱导条件的优化 | 第57-61页 |
| ·引言 | 第57页 |
| ·实验仪器与试剂 | 第57-58页 |
| ·实验菌株 | 第57-58页 |
| ·培养基 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58页 |
| ·诱导条件对表达量的影响 | 第58页 |
| ·酶活测定 | 第58页 |
| ·结果与讨论 | 第58-60页 |
| ·诱导剂加入量对表达量的影响 | 第58-59页 |
| ·诱导时间对表达量的影响 | 第59-60页 |
| ·诱导温度对表达量的影响 | 第60页 |
| ·小结 | 第60-61页 |
| 第五章 结论 | 第61-63页 |
| ·结论 | 第61页 |
| ·问题与建议 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 附录 | 第67-71页 |
| 致谢 | 第71-73页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第73页 |
