| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-14页 |
| 1 引言 | 第14-26页 |
| ·植酸酶概述 | 第14-20页 |
| ·PCR 介导的定点突变技术 | 第20-22页 |
| ·酶分子中的二硫键 | 第22-25页 |
| ·本课题的目的和意义 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-44页 |
| ·实验材料 | 第26-27页 |
| ·实验方法 | 第27-44页 |
| ·产胞外植酸酶菌株的筛选 | 第27页 |
| ·植酸酶基因的克隆及载体构建 | 第27-32页 |
| ·二硫键的突变 | 第32-36页 |
| ·突变体及野生型植酸酶基因酵母分泌型表达载体的构建 | 第36-37页 |
| ·突变体及野生型植酸酶基因在酵母中的诱导表达 | 第37-40页 |
| ·表达产物及纯化后酶蛋白蛋白含量的测定 | 第40页 |
| ·表达产物及纯化后酶蛋白酶活性的测定 | 第40页 |
| ·纯化后酶蛋白糖基化的去除 | 第40页 |
| ·表达产物及纯化后酶蛋白SDS-PAGE 分析 | 第40-41页 |
| ·表达产物及纯化后酶蛋白催化反应动力学分析 | 第41-42页 |
| ·突变体与野生型植酸酶最适反应pH 的测定 | 第42页 |
| ·突变体与野生型植酸酶最适反应温度的测定 | 第42页 |
| ·突变体与野生型植酸酶的荧光光谱分析 | 第42页 |
| ·丙烯酰胺猝灭分析 | 第42-43页 |
| ·突变体与野生型植酸酶热稳定性的测定 | 第43页 |
| ·突变体与野生型植酸酶在变性剂中稳定性的测定 | 第43页 |
| ·突变体与野生型植酸酶的DSC 测定 | 第43-44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-82页 |
| ·高产植酸酶菌株筛选及植酸酶基因的克隆 | 第44-48页 |
| ·高产植酸酶菌株筛选 | 第44页 |
| ·植酸酶phyA 基因的PCR 扩增 | 第44页 |
| ·植酸酶phyA 基因的结构分析 | 第44-48页 |
| ·植酸酶分子中5 对二硫键的缺失突变 | 第48-50页 |
| ·突变体及野生型植酸酶基因酵母表达质粒的构建与表达 | 第50-55页 |
| ·酵母表达质粒的构建 | 第50-51页 |
| ·电击转化毕赤酵母 | 第51-53页 |
| ·突变体及野生型植酸酶phyA 基因在毕赤酵母中的高效表达 | 第53-55页 |
| ·二硫键突变对植酸酶催化特性的影响 | 第55-63页 |
| ·野生型及突变体植酸酶最适pH 测定 | 第55-58页 |
| ·野生型及突变体植酸酶最适反应温度的测定 | 第58-60页 |
| ·野生型及突变体植酸酶的酶促反应动力学分析 | 第60-63页 |
| ·二硫键突变对植酸酶构象的影响 | 第63-67页 |
| ·突变体与野生型植酸酶内源荧光的分析 | 第63-65页 |
| ·丙烯酰胺荧光猝灭分析 | 第65-66页 |
| ·突变体与野生型植酸酶ANS 结合荧光的分析 | 第66-67页 |
| ·突变体与野生型植酸酶在变性剂中的稳定性比较 | 第67-72页 |
| ·突变体与野生型植酸酶在不同浓度盐酸胍溶液中的活性变化 | 第68-69页 |
| ·突变体与野生型植酸酶在不同浓度盐酸胍溶液中的内源荧光变化 | 第69-71页 |
| ·突变体与野生型植酸酶在盐酸胍溶液中的活性变化与构象变化的综合分析 | 第71-72页 |
| ·二硫键突变对植酸酶热稳定性的影响 | 第72-82页 |
| ·不同温度下野生型植酸酶及其突变体的催化活性分析 | 第73-77页 |
| ·热变性过程中野生型植酸酶及其突变体的构象变化分析 | 第77-79页 |
| ·野生型与突变体植酸酶的DSC 分析 | 第79-82页 |
| 4 讨论 | 第82-91页 |
| ·植酸酶的热稳定性研究 | 第82-83页 |
| ·借助蛋白质工程，经由二硫键提高酶蛋白的热稳定性 | 第83-84页 |
| ·不同的二硫键所起的作用不同 | 第84-88页 |
| ·酶蛋白热变性现象的研究 | 第88页 |
| ·酶活性部位的柔性 | 第88-90页 |
| ·研究设想 | 第90-91页 |
| 5 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-111页 |
| 附录 | 第111-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第121页 |
