| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一章 肿瘤坏死因子检测技术及其在PRRSV感染中的作用 | 第11-33页 |
| 1 肿瘤坏死因子 | 第11-12页 |
| ·肿瘤坏死因子的分子生物学特性 | 第11-12页 |
| ·肿瘤坏死因子的生物学活性 | 第12页 |
| 2 肿瘤坏死因子的检测方法 | 第12-17页 |
| ·生物学检测方法 | 第12-13页 |
| ·免疫学检测方法 | 第13页 |
| ·分子生物学检测方法 | 第13-14页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第14-17页 |
| ·实时荧光定量PCR的技术原理 | 第14-15页 |
| ·实时荧光定量PCR的分类 | 第15-16页 |
| ·实时荧光定量PCR技术的应用 | 第16-17页 |
| 3 猪肿瘤坏死因子在PRRSV感染中的作用 | 第17-25页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合症 | 第17-21页 |
| ·病毒形态与理化特征 | 第17-18页 |
| ·病毒基因结构 | 第18页 |
| ·PRRSV的致病机理 | 第18-20页 |
| ·高致病性蓝耳病 | 第20-21页 |
| ·感染蓝耳病病毒后对肺泡巨噬细胞的影响 | 第21页 |
| ·PRRV感染对细胞因子的影响 | 第21-25页 |
| ·PRRSV抑制IFN-α的产生 | 第22页 |
| ·PRRSV诱导细胞因子IL-10 | 第22页 |
| ·PRRSV GP5上诱骗表位(decoy epitop)及糖基化位点对体液免疫的影响 | 第22-23页 |
| ·PRRSV干扰正常的抗原呈递 | 第23-25页 |
| 参考文献 | 第25-33页 |
| 第二章 猪TNF-A基因原核表达与单克隆抗体的制备 | 第33-53页 |
| 摘要 | 第33页 |
| 1 材料与方法 | 第33-45页 |
| ·材料与试剂 | 第33-34页 |
| ·TNF-αA成熟蛋白编码基因的PCR扩增与原核表达质粒的构建 | 第34-38页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·RT-PCR扩增目的片段 | 第34-35页 |
| ·PCR产物回收纯化 | 第35-36页 |
| ·重组质粒的构建 | 第36-38页 |
| ·融合蛋白的表达,纯化及抗原性鉴定 | 第38-42页 |
| ·转化感受态大肠杆菌BL-21 | 第38页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第38页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第38-39页 |
| ·重组蛋白的大量表达 | 第39-40页 |
| ·重组蛋白的亲和层析纯化 | 第40-41页 |
| ·重组蛋白的抗原性鉴定 | 第41-42页 |
| ·动物免疫 | 第42页 |
| ·间接ELISA筛选方法的建立 | 第42页 |
| ·单克隆抗体的制备 | 第42-45页 |
| ·SP2/0骨髓瘤细胞的准备 | 第42-43页 |
| ·饲养细胞的制备 | 第43页 |
| ·脾淋巴细胞的准备与细胞融合 | 第43-44页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的亚克隆 | 第44页 |
| ·腹水的制备 | 第44页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第44-45页 |
| ·单克隆抗体特性的鉴定 | 第45页 |
| ·Western blotting鉴定 | 第45页 |
| ·Ig型鉴定 | 第45页 |
| ·抗体分泌稳定性测定 | 第45页 |
| 2 结果 | 第45-50页 |
| ·TNF-α基因的扩增 | 第45-46页 |
| ·pET-28a-TNF-α原核表达质粒的构建 | 第46页 |
| ·重组蛋白的表达、纯化与抗原性鉴定 | 第46-47页 |
| ·杂交瘤细胞株的筛选 | 第47-48页 |
| ·单抗的Ig亚型鉴定 | 第48页 |
| ·单抗1E2和2F3的特异性鉴定 | 第48-49页 |
| ·杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性鉴定 | 第49-50页 |
| 3 讨论 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-52页 |
| ABSTRACT | 第52-53页 |
| 第三章 PRRSV不同毒株感染猪肺泡巨噬细胞TNF-A变化规律比较研究 | 第53-67页 |
| 摘要 | 第53页 |
| 1 材料与方法 | 第53-54页 |
| ·主要试剂 | 第53-54页 |
| ·肺泡巨噬细胞制备 | 第54页 |
| 2 猪肺泡巨噬细胞PRRSV感染后不同时间TNF-A检测 | 第54-57页 |
| ·定量RT-PCR方法检测TNF-α mRNA | 第54-56页 |
| ·引物设计与合成 | 第54-55页 |
| ·RNA提取 | 第55页 |
| ·逆转录 | 第55-56页 |
| ·Real Time PCR | 第56页 |
| ·数据分析 | 第56页 |
| ·ELISA方法检测TNF | 第56-57页 |
| 3 定量RT-PCR方法检测PRRSV N蛋白MRNA | 第57-59页 |
| ·引物设计与合成 | 第57页 |
| ·RNA提取 | 第57-58页 |
| ·逆转录 | 第58页 |
| ·Real Time PCR | 第58-59页 |
| ·数据分析 | 第59页 |
| 4 结果 | 第59-62页 |
| ·PRRSV在PAM细胞上增殖定量检测 | 第59页 |
| ·TNF-α mRNA定量检测标准曲线绘制 | 第59-60页 |
| ·荧光实时定量PCR检测TNF-α mRNA | 第60-61页 |
| ·ELISA方法检测TNF-α标准样品曲线 | 第61页 |
| ·ELISA方法检测TNF-α | 第61-62页 |
| 5 讨论 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-66页 |
| ABSTRACT | 第66-67页 |
| 全文总结 | 第67-69页 |
| 致谢 | 第69-71页 |
| 附录 | 第71-76页 |
