| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 引言 | 第16-36页 |
| 1.1 囊泡运输和SNARE复合体 | 第16-19页 |
| 1.2 SNARE蛋白与SNARE复合体组装过程 | 第19-24页 |
| 1.3 SNAP25蛋白loop区调控SNARE复合体组装 | 第24-26页 |
| 1.4 核磁共振解析蛋白质结构 | 第26-31页 |
| 1.4.1 蛋白质结构及其研究方法 | 第26-27页 |
| 1.4.2 核磁共振技术原理及特点 | 第27-28页 |
| 1.4.3 核磁共振技术解析蛋白质参数 | 第28-30页 |
| 1.4.4 不同条件对核磁共振谱图的影响 | 第30-31页 |
| 1.5 核磁共振技术解析蛋白质相互作用 | 第31-35页 |
| 1.5.1 蛋白质相互作用强度 | 第32页 |
| 1.5.2 蛋白质相互作用时间尺度 | 第32-34页 |
| 1.5.3 研究蛋白质相互作用的核磁共振方法 | 第34-35页 |
| 1.6 研究的主要内容 | 第35-36页 |
| 第二章 SNAP25蛋白loop区与膜环境作用影响SNARE复合体组装 | 第36-83页 |
| 2.1 引言 | 第36-37页 |
| 2.2 样品与实验方法 | 第37-57页 |
| 2.2.1 实验材料与仪器 | 第37-41页 |
| 2.2.2 蛋白质样品基本性质 | 第41-43页 |
| 2.2.3 质粒构建 | 第43-45页 |
| 2.2.4 感受态细胞制备(氯化钙法制备感受态细胞) | 第45-46页 |
| 2.2.5 质粒转化及挑选单克隆 | 第46-47页 |
| 2.2.6 质粒抽提 | 第47页 |
| 2.2.7 蛋白质定点突变 | 第47页 |
| 2.2.8 蛋白质的表达 | 第47-49页 |
| 2.2.9 蛋白质样品纯化 | 第49-53页 |
| 2.2.10 模拟膜体系制备 | 第53-54页 |
| 2.2.11 圆二色谱CD实验 | 第54-55页 |
| 2.2.12 核磁共振NMR实验 | 第55-56页 |
| 2.2.13 SNARE复合体组装实验 | 第56-57页 |
| 2.3 数据讨论与结果 | 第57-80页 |
| 2.3.1 SNAP25蛋白loop区的半胱氨酸残基影响SNARE复合物组装 | 第57-58页 |
| 2.3.2 SNAP25蛋白loop区的半胱氨酸残基影响其与膜结合 | 第58-66页 |
| 2.3.3 SNAP25蛋白loop区与膜结合造成二级结构改变 | 第66-72页 |
| 2.3.4 膜诱导的构象变化促进SNAP25蛋白loop区与syntaxin结合 | 第72-78页 |
| 2.3.5 SNAP25蛋白loop区羧基末端带正电氨基酸与syntaxin结合 | 第78-80页 |
| 2.4 小结 | 第80-83页 |
| 第三章 SNAP25蛋白loop区翻译后修饰影响SNARE复合体组装 | 第83-103页 |
| 3.1 引言 | 第83-84页 |
| 3.2 样品与实验方法 | 第84-89页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第84-85页 |
| 3.2.2 体外磷酸化反应 | 第85页 |
| 3.2.3 Phos-tag蛋白质凝胶电泳检测磷酸化 | 第85-86页 |
| 3.2.4 PC-12细胞复苏,传代培养和冻存 | 第86-88页 |
| 3.2.5 去内毒素质粒抽提 | 第88页 |
| 3.2.6 PC-12细胞化学转染 | 第88页 |
| 3.2.7 PC-12细胞电转 | 第88-89页 |
| 3.3 数据讨论与结果 | 第89-101页 |
| 3.3.1 SNAP25蛋白及其loop区体外磷酸化检测 | 第89-92页 |
| 3.3.2 SNAP25模拟磷酸化抑制SNARE复合体组装 | 第92-94页 |
| 3.3.3 磷酸化影响SNAP25蛋白loop区与syntaxin的作用 | 第94-95页 |
| 3.3.4 SNAP25蛋白loop区磷酸化造成的长程的构象改变 | 第95-98页 |
| 3.3.5 细胞内实验检测 | 第98-101页 |
| 3.4 小结 | 第101-103页 |
| 第四章 SNAP25蛋白loop区与锌离子作用影响SNARE复合体组装 | 第103-119页 |
| 4.1 引言 | 第103-104页 |
| 4.2 样品与实验方法 | 第104页 |
| 4.2.1 实验材料与仪器 | 第104页 |
| 4.2.2 圆二色谱热力学实验 | 第104页 |
| 4.2.3 伪接触化学位移实验 | 第104页 |
| 4.3 数据讨论与结果 | 第104-117页 |
| 4.3.1 过量的Zn~(2+)对SNARE复合体组装效率的影响 | 第104-105页 |
| 4.3.2 过量的Zn~(2+)与SNARE蛋白相互作用 | 第105-108页 |
| 4.3.3 过量的Zn~(2+)会引起SNAP25蛋白loop区发生构象变化 | 第108-110页 |
| 4.3.4 使用核磁共振技术研究SNAP25蛋白loop区Zn~(2+)结合态的结构 | 第110-113页 |
| 4.3.5 过量的Zn~(2+)会引起SNAP25蛋白loop区与syntaxin的错配 | 第113-117页 |
| 4.4 小结 | 第117-119页 |
| 第五章 SNAP25蛋白相分离的研究 | 第119-130页 |
| 5.1 引言 | 第119-121页 |
| 5.2 样品与实验方法 | 第121-123页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第121页 |
| 5.2.2 扫描电镜样品制备 | 第121页 |
| 5.2.3 分析型超速离心 | 第121-122页 |
| 5.2.4 ~(19)F标记蛋白质 | 第122页 |
| 5.2.5 ~(19)F谱图采集 | 第122-123页 |
| 5.3 数据讨论与结果 | 第123-128页 |
| 5.3.1 SNAP25蛋白的相分离 | 第123-124页 |
| 5.3.2 SNAP25蛋白浓度变化对其构象造成的影响 | 第124-126页 |
| 5.3.3 SNAP25蛋白loop区突变影响其相分离 | 第126-128页 |
| 5.4 小结 | 第128-130页 |
| 第六章 总结与展望 | 第130-134页 |
| 6.1 SNAP25蛋白loop区从无序到有序的结构变化 | 第130-131页 |
| 6.2 SNAP25蛋白loop区与syntaxin蛋白结合对SNARE复合体的影响 | 第131-132页 |
| 6.3 SNAP25蛋白loop区羧基端的动态构象对SNARE复合体的影响 | 第132页 |
| 6.4 展望 | 第132-134页 |
| 参考文献 | 第134-152页 |
| 附录 | 第152-168页 |
| 附录A SNAP25蛋白loop区主链的~1H,~(13)C和~(15)N化学位移指认结果 | 第152-154页 |
| 附录B SNAP25蛋白loop区T138位点磷酸化主链~1H, ~(13)C和~(15)N化学位移指认结果 | 第154-156页 |
| 附录C 实验室常用溶液的配置 | 第156-159页 |
| 附录D 实验室常用试剂盒的使用方法 | 第159-162页 |
| 附录D.1 AXYPREP DNA凝胶回收试剂盒使用方法 | 第159页 |
| 附录D.2 AXYPREP质粒抽提试剂盒使用方法 | 第159-160页 |
| 附录D.3 Omega去内毒素质粒提取试剂盒使用方法 | 第160-162页 |
| 附录E NMRpipe软件谱图处理脚本 | 第162-165页 |
| 附录E1 NMRpipe软件谱图二维谱处理脚本 | 第162页 |
| 附录E2 NMRpipe软件三维谱图HN维处理脚本 | 第162-163页 |
| 附录E3 NMRpipe软件三维谱图HC维处理脚本 | 第163页 |
| 附录E4 NMRpipe软件三维谱图处理脚本 | 第163-165页 |
| 附录F 英文简写索引 | 第165-168页 |
| 致谢 | 第168-170页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第170-171页 |
