| 摘要 | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-33页 |
| 1 脂肪组织发育过程 | 第12-13页 |
| 1.1 前体脂肪细胞的来源 | 第12页 |
| 1.2 脂肪细胞的分化过程 | 第12-13页 |
| 2 脂肪分化的关键调节因子 | 第13-24页 |
| 2.1 脂肪细胞分化的关键转录调节因子 | 第13-17页 |
| 2.1.1 C/EBPs家族 | 第14-15页 |
| 2.1.2 PPARγ | 第15-16页 |
| 2.1.3 KLFs家族 | 第16-17页 |
| 2.1.4 SREBP1 | 第17页 |
| 2.2 脂肪细胞分化的核外调节因子 | 第17-19页 |
| 2.2.1 促进分化的关键核外调节因子 | 第17-18页 |
| 2.2.2 抑制分化的关键核外调节因子 | 第18-19页 |
| 2.3 miRNA对脂肪形成的影响 | 第19-24页 |
| 2.3.1 miRNA的生物合成 | 第19-20页 |
| 2.3.2 促进脂肪形成的miRNA | 第20-22页 |
| 2.3.3 抑制脂肪形成的miRNA | 第22-24页 |
| 参考文献 | 第24-33页 |
| 第二章 不同品种(系)绵羊皮下脂肪组织miRNA表达谱研究 | 第33-57页 |
| 1 材料与方法 | 第33-40页 |
| 1.1 试验材料 | 第33-34页 |
| 1.2 试验试剂 | 第34页 |
| 1.3 主要仪器 | 第34-35页 |
| 1.4 高通量测序文库的构建 | 第35-37页 |
| 1.4.1 皮下脂肪组织RNA提取及纯度检测 | 第35页 |
| 1.4.2 小分子RNA分离 | 第35-36页 |
| 1.4.3 测序文库构建 | 第36-37页 |
| 1.5 测序数据分析 | 第37-38页 |
| 1.5.1 原始数据分析及小RNA长度统计 | 第37页 |
| 1.5.2 Clean reads组成分析 | 第37-38页 |
| 1.5.3 miRNA表达谱分析 | 第38页 |
| 1.5.4 miRNA靶基因预测及功能分析 | 第38页 |
| 1.6 测序数据stem-loop qPCR检验 | 第38-40页 |
| 1.6.1 引物设计 | 第38-39页 |
| 1.6.2 Stem-loop qPCR | 第39-40页 |
| 1.6.3 数据分析 | 第40页 |
| 2 结果 | 第40-51页 |
| 2.1 总RNA浓度及完整性分析结果 | 第40-41页 |
| 2.2 测序数据描述统计 | 第41-42页 |
| 2.3 小RNA分类注释结果 | 第42-43页 |
| 2.4 已知miRNA的识别和差异表达分析 | 第43-45页 |
| 2.5 未知miRNA识别和差异表达分析 | 第45-50页 |
| 2.6 靶基因预测及功能分析 | 第50页 |
| 2.7 测序结果验证 | 第50-51页 |
| 3 讨论 | 第51-55页 |
| 参考文献 | 第55-57页 |
| 第三章 miR-124-3p对绵羊脂肪源前体脂肪细胞分化能力的影响 | 第57-82页 |
| 1 材料与方法 | 第58-70页 |
| 1.1 样品采集 | 第58页 |
| 1.2 主要试剂的配置 | 第58-59页 |
| 1.2.1 细胞分离及培养试剂 | 第58-59页 |
| 1.2.2 Western blotting相关试剂 | 第59页 |
| 1.3 脂肪源前体脂肪细胞的分离 | 第59页 |
| 1.4 细胞成脂诱导分化 | 第59-60页 |
| 1.5 miR-124-3p靶基因预测 | 第60页 |
| 1.6 C/EBPα 3'-UTR双荧光报告载体构建 | 第60-65页 |
| 1.6.1 PCR扩增C/EBPα基因mRNA 3'-UTR | 第60-62页 |
| 1.6.2 C/EBPα基因mRNA 3'-UTR克隆 | 第62-64页 |
| 1.6.3 C/EBPα mRNA 3'-UTR连接到荧光报告载体 | 第64-65页 |
| 1.7 miR124-3p和双荧光报告载体共转染293T细胞 | 第65-66页 |
| 1.8 miR-124-3p在前体脂肪细胞中的过表达和抑制表达 | 第66页 |
| 1.9 实时荧光定量PCR | 第66-68页 |
| 1.9.1 miRNA Stem-loop qPCR检测 | 第66页 |
| 1.9.2 基因mRNA实时荧光定量PCR检测 | 第66-68页 |
| 1.10 Western blotting检测 | 第68-70页 |
| 1.10.1 细胞蛋白提取 | 第68页 |
| 1.10.2 蛋白浓度测定 | 第68页 |
| 1.10.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第68-69页 |
| 1.10.4 蛋白转膜 | 第69页 |
| 1.10.5 抗体孵育 | 第69-70页 |
| 1.11 数据分析 | 第70页 |
| 2 结果 | 第70-75页 |
| 2.1 绵羊脂肪源和肌肉源前体脂肪细胞培养及成脂能力鉴定 | 第70-71页 |
| 2.1.1 前体脂肪细胞分离结果 | 第70页 |
| 2.1.2 分化能力的鉴定 | 第70-71页 |
| 2.2 miR-124-3p靶基因预测结果 | 第71页 |
| 2.3 双荧光报告结果 | 第71-72页 |
| 2.4 miR-124-3p对脂肪源前体脂肪细胞分化的影响 | 第72-75页 |
| 2.4.1 miR-124-3p可抑制脂肪源前体脂肪细胞C/EBPα的表达 | 第72-74页 |
| 2.4.2 miR-124-3p抑制前体脂肪细胞脂肪生成标志基因的表达 | 第74页 |
| 2.4.3 miR-124-3p可抑制脂肪细胞脂滴的生成 | 第74-75页 |
| 3 讨论 | 第75-79页 |
| 参考文献 | 第79-82页 |
| 第四章 miR-124-3p对绵羊肌肉源前体脂肪细胞分化的影响 | 第82-107页 |
| 1 材料与方法 | 第83-90页 |
| 1.1 样品采集 | 第83页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第83页 |
| 1.3 肌肉源前体脂肪细胞的分离 | 第83页 |
| 1.4 miR-124-3p靶基因预测 | 第83页 |
| 1.5 BCKDHA 3'-UTR双荧光报告载体的构建 | 第83-84页 |
| 1.5.1 引物设计 | 第83-84页 |
| 1.5.2 BCKDHA基因mRNA 3,-UTR的PCR扩增 | 第84页 |
| 1.5.3 BCKDHA基因mRNA 3'-UTR的克隆及连接到荧光报告载体 | 第84页 |
| 1.6 BCKDHA表达载体的构建 | 第84-86页 |
| 1.6.1 引物设计 | 第84-85页 |
| 1.6.2 CDS的PCR扩增 | 第85页 |
| 1.6.3 载体的线性化 | 第85页 |
| 1.6.4 重组质粒的构建及克隆 | 第85-86页 |
| 1.7 BCKDHA基因慢病毒干扰载体的构建 | 第86-87页 |
| 1.7.1 shRNA序列的合成 | 第86页 |
| 1.7.2 干扰载体的重组 | 第86-87页 |
| 1.8 慢病毒包装 | 第87-88页 |
| 1.9 前体脂肪细胞感染慢病毒 | 第88页 |
| 1.9.1 最适Polybrene浓度的确定 | 第88页 |
| 1.9.2 慢病毒滴度测定 | 第88页 |
| 1.9.3 慢病毒感染绵羊前体脂肪细胞 | 第88页 |
| 1.10 实时荧光定量PCR | 第88-89页 |
| 1.11 Western blotting检测 | 第89页 |
| 1.12 支链氨基酸的检测 | 第89-90页 |
| 1.13 数据分析 | 第90页 |
| 2 结果 | 第90-100页 |
| 2.1 绵羊肌肉源前体脂肪细胞的培养及成脂能力鉴定 | 第90-92页 |
| 2.1.1 前体脂肪细胞分离结果 | 第90页 |
| 2.1.2 细胞分化能力的鉴定 | 第90-92页 |
| 2.2 miR-124-3p靶基因预测结果 | 第92页 |
| 2.3 双荧光报告检测结果 | 第92-93页 |
| 2.4 miR-124-3p对肌肉源前体脂肪细胞分化的影响 | 第93-97页 |
| 2.4.1 miR-124-3p和BCKDHA在脂肪细胞分化过程中的表达 | 第93页 |
| 2.4.2 miR-124-3p对于前体脂肪细胞脂滴形成的影响 | 第93-95页 |
| 2.4.3 miR-124-3p对细胞分化过程中BCKDHA的影响 | 第95-96页 |
| 2.4.4 miR-124-3p对支链氨基酸代谢的影响 | 第96-97页 |
| 2.5 BCKDHA可促进肌肉源前体脂肪细胞的分化 | 第97-100页 |
| 2.5.1 BCKDHA慢病毒表达系统构建结果 | 第97-99页 |
| 2.5.2 BCKDHA对前体脂肪细胞分化能力的影响 | 第99-100页 |
| 3 讨论 | 第100-104页 |
| 参考文献 | 第104-107页 |
| 全文结论 | 第107-108页 |
| 创新与特色 | 第108-110页 |
| 附录一 源于多个测序文库的已知miRNA的聚类分析 | 第110-111页 |
| 附录二 源于多个测序文库的未知miRNA的聚类分析 | 第111-112页 |
| 附录三 小尾寒羊文库中miRNA的基因组分布 | 第112-113页 |
| 附录四 山西肉用绵羊母本品系中miRNA的基因组分布 | 第113-114页 |
| 附录五 在读期间发表论文 | 第114-116页 |
| Abstract | 第116-117页 |
| 致谢 | 第118页 |
