| 致谢 | 第4-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| 文献综述一 猪细小病毒的研究进展 | 第11-22页 |
| 1 PPV的病原学研究 | 第11-14页 |
| 1.1 PPV病原学一般特征 | 第11页 |
| 1.2 PPV基因组结构特征 | 第11-12页 |
| 1.3 PPV主要蛋白分析 | 第12页 |
| 1.4 PPV毒株分型 | 第12-13页 |
| 1.5 PPV的血凝性 | 第13页 |
| 1.6 PPV的细胞培养特性 | 第13页 |
| 1.7 PPV的理化特性分析 | 第13-14页 |
| 2 PPV诊断方法及研究进展 | 第14-18页 |
| 2.1 PPV的分离与鉴定 | 第14页 |
| 2.2 血清学诊断方法 | 第14-16页 |
| 2.2.1 血凝(HA)和血凝抑制试验(HI) | 第15页 |
| 2.2.2 乳胶凝集试验(LAT) | 第15页 |
| 2.2.3 PPV免疫层析试纸快速检测技术 | 第15页 |
| 2.2.4 血清中和试验(SN) | 第15-16页 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第16页 |
| 2.3 PPV分子诊断技术 | 第16-18页 |
| 2.3.1 PCR检测技术 | 第16-17页 |
| 2.3.2 PPV环介导等温扩增(LAMP)技术 | 第17-18页 |
| 2.3.3 核酸探针技术 | 第18页 |
| 3 PPV的疫苗研究进展 | 第18-22页 |
| 3.1 PPV常规疫苗 | 第18-19页 |
| 3.1.1 PPV灭活疫苗 | 第18-19页 |
| 3.1.2 PPV弱毒疫苗 | 第19页 |
| 3.2 PPV新型疫苗 | 第19-22页 |
| 3.2.1 核酸疫苗 | 第20页 |
| 3.2.2 基因工程亚单位疫苗 | 第20-21页 |
| 3.2.3 病毒活载体疫苗 | 第21-22页 |
| 文献综述二 猪伪狂犬病病毒活载的研究进展 | 第22-26页 |
| 1 PRV的病原与生物学特性 | 第22-23页 |
| 1.1 PRV病原学特征 | 第22页 |
| 1.2 PRV的分子生物学特性 | 第22-23页 |
| 2 PRV作为病毒活载体的研究现状 | 第23-24页 |
| 2.1 PRV基因缺失株的相关研究 | 第23页 |
| 2.2 PRV转移载体相关研究 | 第23-24页 |
| 3 PRV重组疫苗的研究进展和前景 | 第24-26页 |
| 3.1 PRV重组疫苗的相关研究 | 第24-25页 |
| 3.2 PRV重组疫苗的应用前景 | 第25-26页 |
| 试验一 猪细小病毒VP2基因重组伪狂犬病病毒活载体的构建 | 第26-42页 |
| 1 材料与方法 | 第26-35页 |
| 1.1 材料 | 第26页 |
| 1.1.1 病毒与质粒 | 第26页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第26页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第26页 |
| 1.2 方法 | 第26-35页 |
| 1.2.1 重组病毒rPRV PGVP2的构建技术路线 | 第26-28页 |
| 1.2.2 引物设计与合成 | 第28页 |
| 1.2.3 重组质粒pMD-VP2的构建 | 第28-31页 |
| 1.2.3.1 PPV的培养与病毒DNA的提取 | 第28页 |
| 1.2.3.2 PPV VP2基因的扩增与克隆 | 第28页 |
| 1.2.3.3 PCR产物的纯化回收 | 第28-29页 |
| 1.2.3.4 PCR产物的连接 | 第29-30页 |
| 1.2.3.5 连接产物的转化与挑斑 | 第30页 |
| 1.2.3.6 重组质粒pMD-VP2的提取 | 第30-31页 |
| 1.2.3.7 重组质粒pMD-VP2的PCR及酶切鉴定 | 第31页 |
| 1.2.3.8 VP2基因片段序列测定 | 第31页 |
| 1.2.4 pGVP2转移质粒的构建 | 第31-33页 |
| 1.2.4.1 pG质粒的酶切及去磷酸化 | 第31页 |
| 1.2.4.2 质粒pMD-VP2的BamHI酶切 | 第31-32页 |
| 1.2.4.3 载体(pG)与外源DNA目的片段(VP2)的连接 | 第32页 |
| 1.2.4.4 连接产物转化 | 第32页 |
| 1.2.4.5 重组质粒pGVP2的提取 | 第32页 |
| 1.2.4.6 重组质粒pGVP2的PCR及酶切鉴定 | 第32页 |
| 1.2.4.7 重组质粒pGVP2中VP2基因的方向鉴定 | 第32-33页 |
| 1.2.4.8 VP2基因克隆片段的序列测定 | 第33页 |
| 1.2.5 PRV的增殖 | 第33页 |
| 1.2.6 PRV病毒基因组的提取 | 第33-34页 |
| 1.2.7 转移载体重组质粒(pGVP2)的提取 | 第34页 |
| 1.2.8 转染细胞的准备 | 第34-35页 |
| 1.2.9 脂质体介导的共转染 | 第35页 |
| 1.3 重组病毒rPRV PGVP2中VP2片段的PCR扩增 | 第35页 |
| 2 结果与分析 | 第35-40页 |
| 2.1 PPV VP2基因的PCR扩增结果 | 第35-36页 |
| 2.2 重组质粒pMD-VP2的PCR及酶切鉴定结果 | 第36-37页 |
| 2.3 重组质粒pMD-VP2中VP2片段的序列测定 | 第37-38页 |
| 2.4 重组质粒pGVP2的PCR及酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 2.5 重组质粒pGVP2中VP2基因片段的序列测定 | 第39页 |
| 2.6 重组病毒的绿色荧光观察 | 第39页 |
| 2.7 重组病毒rPRV PGVP2中VP2片段的PCR鉴定结果 | 第39-40页 |
| 3 结论与讨论 | 第40-42页 |
| 3.1 PRV重组PPV VP2的立题依据与意义 | 第40页 |
| 3.2 PPV VP2结构蛋白分析 | 第40页 |
| 3.3 关于病毒载体的选择 | 第40页 |
| 3.4 关于转移质粒pGVP2的构建 | 第40-41页 |
| 3.5 病毒重组的关键步骤分析 | 第41-42页 |
| 试验二 重组病毒株rPRV PGVP2的纯化及部分生物学特性分析 | 第42-60页 |
| 1 材料与方法 | 第42-45页 |
| 1.1 试验材料 | 第42页 |
| 1.1.1 细胞和毒株 | 第42页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第42页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第42页 |
| 1.2 重组病毒rPRV PGVP2的空斑筛选 | 第42-43页 |
| 1.3 重组病毒在多种细胞上的毒价测定 | 第43页 |
| 1.4 重组病毒在多种细胞上的培养特性 | 第43页 |
| 1.5 重组病毒与亲本株在ST细胞上的毒价测定 | 第43页 |
| 1.6 重组病毒的一步生长曲线测定 | 第43-44页 |
| 1.7 重组病毒的遗传稳定性评价 | 第44页 |
| 1.8 重组病毒中VP2基因在ST细胞上的转录及表达检测 | 第44-45页 |
| 1.8.1 重组病毒rPRV PGVP2株VP2基因在细胞中转录检测 | 第44页 |
| 1.8.2 重组病毒的SDS-PAGE电泳与Western blot检测 | 第44-45页 |
| 1.9 重组病毒的安全性初步检测 | 第45页 |
| 2 结果与分析 | 第45-58页 |
| 2.1 重组病毒的空斑筛选 | 第45-46页 |
| 2.2 重组病毒在多种细胞上的毒价测定结果 | 第46页 |
| 2.3 重组病毒rPRV PGVP2株在多种细胞上的培养特性观察 | 第46-54页 |
| 2.3.1 重组病毒rPRV PGVP2株在ST细胞上的培养特性观察 | 第46-48页 |
| 2.3.2 重组病毒rPRV PGVP2株在PK-15细胞上的培养特性观察 | 第48-50页 |
| 2.3.3 重组病毒rPRV PGVP2株在VERO细胞上的培养特性观察 | 第50-52页 |
| 2.3.4 重组病毒rPRV PGVP2株在IPEC细胞上的培养特性观察 | 第52-54页 |
| 2.4 重组病毒与亲本株在ST细胞上的毒价测定结果 | 第54页 |
| 2.5 重组病毒的一步生长曲线测定 | 第54-55页 |
| 2.6 重组病毒的遗传稳定性分析 | 第55-57页 |
| 2.7 RT-PCR检测重组病毒中VP2基因在细胞中的转录 | 第57页 |
| 2.8 Western blot检测PPV VP2蛋白表达 | 第57-58页 |
| 2.9 重组病毒rPRV PGVP2株的安全性检测结果 | 第58页 |
| 3 结论与讨论 | 第58-60页 |
| 3.1 关于重组病毒rPRV PGVP2的空斑纯化 | 第58页 |
| 3.2 重组病毒rPRV PGVP2的培养增殖特性观察 | 第58-59页 |
| 3.3 关于重组病毒在最适细胞中增殖规律的探索 | 第59页 |
| 3.4 关于重组病毒在细胞内增殖时VP2蛋白表达的测定 | 第59-60页 |
| 试验三 表达PPV VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒的免疫原性研究 | 第60-68页 |
| 1 材料与方法 | 第60-63页 |
| 1.1 材料 | 第60页 |
| 1.1.1 试验动物 | 第60页 |
| 1.1.2 疫苗及毒种 | 第60页 |
| 1.1.3 主要试剂及仪器 | 第60页 |
| 1.2 试验动物免疫分组及血清制备 | 第60-61页 |
| 1.3 血凝抑制试验(HI)检测PPV抗体 | 第61页 |
| 1.3.1 1％豚鼠红细胞悬液的制备 | 第61页 |
| 1.3.2 PPV的血凝试验(HA) | 第61页 |
| 1.3.3 待检血清的处理 | 第61页 |
| 1.3.4 血凝抑制试验(HI) | 第61页 |
| 1.4 间接ELISA检测PPV抗体水平 | 第61-62页 |
| 1.4.1 血清的制备 | 第61-62页 |
| 1.4.2 PPV抗体检测 | 第62页 |
| 1.5 血清中和试验检测PRV抗体水平 | 第62页 |
| 1.6 小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定 | 第62-63页 |
| 1.7 攻毒保护试验 | 第63页 |
| 1.7.1 PRV NY强毒株对于小鼠的致死剂量探索 | 第63页 |
| 1.7.2 免疫小鼠的PRV攻毒保护试验 | 第63页 |
| 1.8 数据处理 | 第63页 |
| 2 结果与分析 | 第63-66页 |
| 2.1 血凝抑制试验(HI)检测PPV抗体结果 | 第63-64页 |
| 2.2 间接ELISA检测PPV抗体结果 | 第64页 |
| 2.3 血清中和试验检测PRV抗体结果 | 第64-65页 |
| 2.4 小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定 | 第65-66页 |
| 2.5 攻毒保护试验 | 第66页 |
| 3 结论与讨论 | 第66-68页 |
| 3.1 重组病毒rPRV PGVP2对小鼠的体液免疫效果分析 | 第66-67页 |
| 3.2 重组病毒rPRV PGVP2对小鼠的细胞免疫效果分析 | 第67页 |
| 3.3 PRV攻毒保护试验分析 | 第67-68页 |
| 全文总结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| ABSTRACT | 第74-75页 |
| 攻读硕士期间发表的论文 | 第76页 |
