| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第1章 引言 | 第16-43页 |
| 1.1 双组分信号转导系统 | 第16-27页 |
| 1.1.1 双组分信号转导系统的机理 | 第16-18页 |
| 1.1.2 HK蛋白的结构特点 | 第18-22页 |
| 1.1.3 RR蛋白的结构特点 | 第22-23页 |
| 1.1.4 双组分体系中的磷酸化机制 | 第23-27页 |
| 1.2 蛋白质的核磁共振研究 | 第27-37页 |
| 1.2.1 核磁共振的基本原理 | 第27-28页 |
| 1.2.2 核磁共振研究生物大分子性质的主要参数 | 第28-31页 |
| 1.2.3 顺磁技术在蛋白质结构方面的应用 | 第31-34页 |
| 1.2.4 蛋白质动力学性质研究 | 第34-37页 |
| 1.3 ~(19)F标记在核磁共振方面的应用 | 第37-39页 |
| 1.4 研究蛋白质的其他辅助手段 | 第39-41页 |
| 1.4.1 动态光散射 | 第39-40页 |
| 1.4.2 圆二色谱 | 第40页 |
| 1.4.3 质谱 | 第40-41页 |
| 1.4.4 分析型超高速离心 | 第41页 |
| 1.5 研究的主要内容 | 第41-43页 |
| 第2章 反应调节蛋白PhoB_N及其突变体的制备表征 | 第43-56页 |
| 2.1 前言 | 第43-45页 |
| 2.2 材料与方法 | 第45-52页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第45页 |
| 2.2.2 PhoB_N以及突变体的重组质粒构建 | 第45-48页 |
| 2.2.3 PhoB_N及其突变体的表达 | 第48-50页 |
| 2.2.4 蛋白质纯化 | 第50-51页 |
| 2.2.5 圆二色谱(CD)实验 | 第51页 |
| 2.2.6 分析型超速离心(AUC)实验 | 第51-52页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第52-55页 |
| 2.3.1 PhoB_N的表达和提纯 | 第52-53页 |
| 2.3.2 选择性标记结果 | 第53页 |
| 2.3.3 CD实验结果分析 | 第53-54页 |
| 2.3.4 AUC结果分析 | 第54-55页 |
| 2.4 结论 | 第55-56页 |
| 第3章 PhoB_N及其突变体的主链归属 | 第56-64页 |
| 3.1 前言 | 第56-57页 |
| 3.2 材料与方法 | 第57-59页 |
| 3.2.1 样品制备 | 第57页 |
| 3.2.2 NMR实验 | 第57-59页 |
| 3.2.3 自由态PhoB_N及其突变体的主链归属 | 第59页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第59-63页 |
| 3.3.1 apo-PhoB_N的NMR主链信号归属 | 第59-61页 |
| 3.3.2 apo-PhoBN~(F20D)的NMR主链信号归属 | 第61-63页 |
| 3.3.3 BeF_3~--PhoB_N结合态蛋白以及其他突变体的归属 | 第63页 |
| 3.4 结论 | 第63-64页 |
| 第4章 野生型PhoB_N在溶液中的构象变化 | 第64-76页 |
| 4.1 前言 | 第64-65页 |
| 4.2 材料与方法 | 第65-68页 |
| 4.2.1 样品制备 | 第65页 |
| 4.2.2 pH滴定实验 | 第65页 |
| 4.2.3 温度实验 | 第65页 |
| 4.2.4 动态光散射实验 | 第65-66页 |
| 4.2.5 T_1、T_2、异核NOE实验 | 第66-67页 |
| 4.2.6 浓度稀释实验 | 第67页 |
| 4.2.7 分子间PRE实验 | 第67-68页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第68-75页 |
| 4.3.1 PhoB_N在高浓度下容易形成二聚体 | 第68-70页 |
| 4.3.2 PhoB_N在溶液中形成的界面不唯一 | 第70-72页 |
| 4.3.3 分子间PRE分析PhoB_N二聚界面的变化 | 第72-75页 |
| 4.4 结论 | 第75-76页 |
| 第5章 自由态PhoB_N~(F20D)在溶液中存在活性构象 | 第76-87页 |
| 5.1 前言 | 第76-77页 |
| 5.2 材料与方法 | 第77-78页 |
| 5.2.1 样品制备 | 第77页 |
| 5.2.2 T_1、T_2、异核NOE实验 | 第77页 |
| 5.2.3 BeF_3~-和Mg~(2+)滴定实验 | 第77页 |
| 5.2.4 CPMG实验 | 第77-78页 |
| 5.2.5 分子间PRE实验 | 第78页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第78-86页 |
| 5.3.0 PhoB_N~(F20D)与wt-PhoB结构相近 | 第78-79页 |
| 5.3.1 PhoB_N~(F20D)在溶液中主要以单体形式存在 | 第79-81页 |
| 5.3.2 PhoB_N~(F20D)在没有Mg~(2+)的情况下可以被BeF_3~-部分磷酸化 | 第81-82页 |
| 5.3.3 PhoB_N~(F20D)在溶液中存在pre-active构象 | 第82-83页 |
| 5.3.4 CPMG实验证明PhoB_N~(F20D)存在两态交换 | 第83-84页 |
| 5.3.5 分子间PRE实验 | 第84-86页 |
| 5.4 结论 | 第86-87页 |
| 第6章 用BeF_3~-以及~(19)F标记研究PhoB_N的磷酸化机制 | 第87-105页 |
| 6.1 前言 | 第87-89页 |
| 6.2 材料与方法 | 第89-90页 |
| 6.2.1 BeF_3~-的配制 | 第89页 |
| 6.2.2 BeF_3~-滴定蛋白质 | 第89页 |
| 6.2.3 Mg~(2+)滴定实验 | 第89页 |
| 6.2.4 CEST实验 | 第89-90页 |
| 6.2.5 ~(19)F-Trp标记实验 | 第90页 |
| 6.2.6 W46F、W54I、M55A、L56A、R85E等位点突变 | 第90页 |
| 6.2.7 phostag PAGE实验 | 第90页 |
| 6.2.8 NMR实验 | 第90页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第90-103页 |
| 6.3.1 BeF_3~-对PhoB_N的磷酸化 | 第90-91页 |
| 6.3.2 Mg~(2+)对PhoB_N磷酸化过程的影响 | 第91-92页 |
| 6.3.3 Mg~(2+)影响loop β3-α3的运动 | 第92-95页 |
| 6.3.4 D+2、D+3与T+2残基对磷酸化功能的影响 | 第95-98页 |
| 6.3.5 初步探究二聚界面对PhoB_N磷酸化功能的影响 | 第98-100页 |
| 6.3.6 W54突变体对PhoB_N~(F20D)磷酸化过程的影响 | 第100-103页 |
| 6.4 结论 | 第103-105页 |
| 第7章 总结与展望 | 第105-108页 |
| 7.1 RR蛋白构象变化的多样性 | 第105-106页 |
| 7.2 结构和动力学的关联 | 第106页 |
| 7.3 磷酸化机制 | 第106-107页 |
| 7.4 展望 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-128页 |
| 附录A 常用培养基配方 | 第128-130页 |
| 附录B 电泳胶配方 | 第130-132页 |
| 附录C 两点法测量蛋白质的PRE效应 | 第132-136页 |
| 附录D CEST实验处理过程 | 第136-140页 |
| 附录E 氨基酸英文简写索引 | 第140-142页 |
| 致谢 | 第142-144页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第144-145页 |
