| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一部分 文献综述 | 第10-20页 |
| 1.抗体以及骆驼纳米抗体 | 第10-13页 |
| 2.B细胞抗体库以及高通量测序技术 | 第13-15页 |
| 3.血清抗体库以及质谱技术 | 第15-17页 |
| 4.质谱技术和高通量测序技术在抗体发现和抗体制备中的应用 | 第17-18页 |
| 5.蛋白组学和高通量测序技术在疾病中运用 | 第18页 |
| 展望 | 第18-20页 |
| 第二部分 骆驼免疫抗体库高通量测序分析以及纳米抗体数据库的建立 | 第20-33页 |
| 引言 | 第20-21页 |
| 1.实验材料 | 第21-22页 |
| 1.1 实验动物 | 第21页 |
| 1.2 菌种 | 第21页 |
| 1.3 主要试剂 | 第21-22页 |
| 1.4 试验引物 | 第22页 |
| 1.5 主要溶液配制 | 第22页 |
| 2.实验方法 | 第22-25页 |
| 2.1 抗原CD47的大量诱导表达以及纯化 | 第22页 |
| 2.2 WesternBlot检测抗原CD47表达 | 第22-23页 |
| 2.3 新疆双峰驼的抗原免疫 | 第23页 |
| 2.4 间接ELISA检测骆驼血清中抗CD47抗体滴度 | 第23-24页 |
| 2.5 新疆双峰驼全血中外周淋巴细胞的分离 | 第24页 |
| 2.6 新疆双峰驼外周淋巴细胞总RNA的提取以及反转录 | 第24页 |
| 2.7 巢式PCR扩增VHH基因片段 | 第24-25页 |
| 2.8 VHH序列的NGS测序以及NGS氨基酸数据库的建立 | 第25页 |
| 3.实验结果 | 第25-32页 |
| 3.1 抗原CD47的纯化以及WesternBlot鉴定 | 第25-26页 |
| 3.2 抗原CD47免疫新疆双峰驼血清效价测定 | 第26-27页 |
| 3.3 骆驼外周淋巴细胞RNA的提取以及VHH片段的获得 | 第27-28页 |
| 3.4 NGS原始数据的处理 | 第28-30页 |
| 3.5 VHH抗体库NGS测定以及CDR3序列以及等电点分析 | 第30-31页 |
| 3.6 抗CD47纳米抗体氨基酸数据库的建立 | 第31-32页 |
| 4.讨论 | 第32-33页 |
| 第三部分 骆驼免疫血清中抗CD47特异性抗体的制备和鉴定 | 第33-46页 |
| 引言 | 第33-34页 |
| 1.实验材料 | 第34-35页 |
| 1.1 实验主要试剂 | 第34页 |
| 1.2 主要溶液的配制 | 第34-35页 |
| 2.实验方法 | 第35-37页 |
| 2.1 利用ProteinA纯化骆驼血清中IgG的纯化 | 第35页 |
| 2.2 CD47免疫和柱制备 | 第35页 |
| 2.3 CD47-IgG的免疫亲和纯化 | 第35-36页 |
| 2.4 间接ELISA筛选抗CD47特异性抗体洗脱液 | 第36页 |
| 2.5 ELISA和WesternBlot鉴定抗CD47-IgG结合活性 | 第36页 |
| 2.6 ELISA检测免疫血清,免疫IgG和抗CD47-IgG与真核CD47结合活性 | 第36页 |
| 2.7 细胞ELISA检测免疫血清,免疫IgG和抗CD47-IgG与EC9706结合活性 | 第36-37页 |
| 3.实验结果 | 第37-44页 |
| 3.1 骆驼血清IgG的纯化以及ELISA检测与原核CD47结合活性 | 第37-38页 |
| 3.2 免疫亲和层析柱的偶联 | 第38-39页 |
| 3.3 抗CD47特异性抗体洗脱液的筛选 | 第39-40页 |
| 3.4 抗CD47特异性抗体的纯化 | 第40-41页 |
| 3.5 ELISA和WesternBlot检测抗CD47特异性抗体与原核CD47结合活性 | 第41-42页 |
| 3.6 血清、IgG以及抗特异性CD47多克隆抗与真核CD47结合性检测 | 第42-43页 |
| 3.7 血清、IgG以及抗特异性CD47多克隆抗体与EC9706结合性检测 | 第43-44页 |
| 4.讨论 | 第44-46页 |
| 第四部分 骆驼重链抗体的质谱分析以及抗CD47纳米抗体制备和鉴定 | 第46-66页 |
| 引言 | 第46-48页 |
| 1.实验材料 | 第48页 |
| 2.实验方法 | 第48-51页 |
| 2.1 样品制备 | 第48页 |
| 2.2 胶内酶解 | 第48-49页 |
| 2.3 质谱分析 | 第49-50页 |
| 2.3.1 毛细管高效液相色谱 | 第49页 |
| 2.3.2 质谱鉴定 | 第49-50页 |
| 2.4 数据分析 | 第50页 |
| 2.5 纳米抗体克隆表达,纯化 | 第50页 |
| 2.6 ELISA鉴定抗CD47纳米抗体结合活性 | 第50-51页 |
| 2.7 噬菌体展示技术筛选的阳性克隆与高通量测序和质谱数据的相关分析 | 第51页 |
| 3.实验结果 | 第51-64页 |
| 3.1 LCMS/MS数据分析 | 第51-59页 |
| 3.2 VHH纳米抗体克隆表达,纯化以及鉴定 | 第59-61页 |
| 3.3 重组纳米抗体与原核CD47结合活性鉴定 | 第61-62页 |
| 3.4 重组纳米抗体VHH-737446与真核CD47结合活性鉴定 | 第62-63页 |
| 3.5 噬菌体筛选的阳性克隆序列与NGS数据库和质谱分析结果的序列比对 | 第63-64页 |
| 4.讨论 | 第64-66页 |
| 第五部分 结论和展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 英文缩略词 | 第72-73页 |
| 参与课题及发表文章 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
