| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 1 绪论 | 第16-25页 |
| 1.1 引言 | 第16页 |
| 1.2 环氧化物水解酶简介 | 第16-19页 |
| 1.2.1 环氧化物水解酶的分类 | 第16-17页 |
| 1.2.2 环氧化物水解酶结构 | 第17页 |
| 1.2.3 环氧化物水解酶生理功能 | 第17-18页 |
| 1.2.4 环氧化物水解酶水解机理 | 第18-19页 |
| 1.3 环氧化物水解酶改造 | 第19-20页 |
| 1.3.1 基因克隆与表达 | 第19页 |
| 1.3.2 定点突变 | 第19-20页 |
| 1.3.3 定向进化 | 第20页 |
| 1.4 产环氧化物水解酶微生物的筛选 | 第20-22页 |
| 1.4.1 环氧化物为唯一碳源的筛选 | 第20-21页 |
| 1.4.2 分光光度法测定环氧化物水解酶活性 | 第21页 |
| 1.4.3 其他方法 | 第21-22页 |
| 1.5 环氧化物水解酶的应用 | 第22-24页 |
| 1.5.1 紫杉醇的合成 | 第22页 |
| 1.5.2 手型环氧氯丙烷的制备 | 第22-23页 |
| 1.5.3 拆分环氧苯乙烯制备手型苯基乙二醇 | 第23页 |
| 1.5.4 制备手性苄基缩水甘油醚 | 第23-24页 |
| 1.5.5 其他手性中间体的合成 | 第24页 |
| 1.6 问题与展望 | 第24-25页 |
| 2 环氧化物水解酶(PchEHA)基因随机突变文库的构建 | 第25-39页 |
| 2.1 引言 | 第25-26页 |
| 2.2 实验材料 | 第26-29页 |
| 2.2.1 菌株 | 第26页 |
| 2.2.2 质粒 | 第26-27页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第27页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.5 引物序列 | 第28页 |
| 2.2.6 培养基 | 第28页 |
| 2.2.7 溶液配制 | 第28-29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-31页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备和转化 | 第29-30页 |
| 2.3.2 质粒DNA的提取 | 第30页 |
| 2.3.3 突变PCR | 第30页 |
| 2.3.4 突变PCR产物的片段化及回收 | 第30-31页 |
| 2.3.5 组装PCR | 第31页 |
| 2.3.6 突变基因的再组装 | 第31页 |
| 2.3.7 克隆与测序 | 第31页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第31-37页 |
| 2.4.1 突变PCR | 第31-32页 |
| 2.4.2 突变PCR产物的酶切 | 第32页 |
| 2.4.3 组装PCR | 第32-34页 |
| 2.4.4 加引物获得大量突变基因 | 第34-35页 |
| 2.4.5 克隆突变PCR产物 | 第35-36页 |
| 2.4.6 突变效果检测 | 第36-37页 |
| 2.5 讨论 | 第37-38页 |
| 2.6 小结 | 第38-39页 |
| 3 PchEHA基因突变文库的筛选及酶活测定 | 第39-62页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 实验材料 | 第39-42页 |
| 3.2.1 菌株 | 第39-40页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第40页 |
| 3.2.3 溶液配制 | 第40-42页 |
| 3.3 实验方法 | 第42-46页 |
| 3.3.1 随机突变文库初筛 | 第42页 |
| 3.3.2 三角瓶发酵复筛 | 第42-43页 |
| 3.3.3 突变基因序列的测定 | 第43页 |
| 3.3.4 突变基因的诱导表达 | 第43页 |
| 3.3.5 SDS-PAGE电泳 | 第43-44页 |
| 3.3.6 蛋白质的纯化 | 第44-45页 |
| 3.3.7 蛋白的透析、浓缩与定量 | 第45页 |
| 3.3.8 酶活测定 | 第45-46页 |
| 3.4 结果 | 第46-58页 |
| 3.4.1 文库初筛 | 第46-47页 |
| 3.4.2 PchEHA酶活力复筛 | 第47-48页 |
| 3.4.3 突变基因序列的测定及分析 | 第48-50页 |
| 3.4.4 蛋白的表达与纯化 | 第50-51页 |
| 3.4.5 蛋白的定量 | 第51页 |
| 3.4.6 酶活测定分析 | 第51-58页 |
| 3.5 讨论 | 第58-61页 |
| 3.5.1 突变文库的筛选 | 第58-59页 |
| 3.5.2 蛋白的表达和纯化 | 第59-60页 |
| 3.5.3 突变位点分布与分析 | 第60-61页 |
| 3.5.4 突变体酶活性分析 | 第61页 |
| 3.6 小结 | 第61-62页 |
| 4 环氧化物水解酶(PchEHA)定点突变及酶活测定 | 第62-77页 |
| 4.1 引言 | 第62页 |
| 4.2 实验材料 | 第62-63页 |
| 4.2.1 菌株 | 第62-63页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第63页 |
| 4.2.3 引物序列 | 第63页 |
| 4.3 实验方法 | 第63-64页 |
| 4.3.1 定点突变 | 第63-64页 |
| 4.3.2 环氧化物水解酶催化动力学特性的测定 | 第64页 |
| 4.4 结果 | 第64-75页 |
| 4.4.1 突变位点的确定 | 第64页 |
| 4.4.2 突变基因的构建 | 第64-65页 |
| 4.4.3 蛋白的表达与纯化 | 第65-66页 |
| 4.4.4 蛋白定量 | 第66页 |
| 4.4.5 酶活力测定 | 第66-70页 |
| 4.4.6 环氧化物水解酶催化动力学特性的测定 | 第70-73页 |
| 4.4.7 PchEHA突变体三维结构的局部变化 | 第73-75页 |
| 4.5 讨论 | 第75-76页 |
| 4.5.1 PchEHA三维结构 | 第75页 |
| 4.5.2 定点突变 | 第75页 |
| 4.5.3 组合突变酶活性分析 | 第75-76页 |
| 4.6 小结 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-90页 |
| 附录 | 第90-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 在读期间发表或被接收的文章 | 第102页 |