| 致谢 | 第4-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-14页 |
| 1.1 转录因子概况 | 第9页 |
| 1.2 WRKY类转录因子 | 第9-11页 |
| 1.2.1 WRKY简介 | 第9页 |
| 1.2.2 WRKY分类 | 第9-10页 |
| 1.2.3 WRKY家族起源与进化 | 第10页 |
| 1.2.4 WRKY转录因子的生物学功能 | 第10-11页 |
| 1.3 WRKY转录因子的表达调控 | 第11-13页 |
| 1.4 蛋白原核表达系统 | 第13-14页 |
| 2 引言 | 第14-15页 |
| 3 材料与方法 | 第15-27页 |
| 3.1 材料及培养条件 | 第15-16页 |
| 3.1.1 试验材料 | 第15页 |
| 3.1.2 烟草生长条件 | 第15页 |
| 3.1.3 BY2生长条件 | 第15-16页 |
| 3.1.4 菌株、载体及主要试剂 | 第16页 |
| 3.1.5 主要仪器 | 第16页 |
| 3.2 试验方法 | 第16-27页 |
| 3.2.1 总RNA的提取及mRNA的反转录 | 第16-17页 |
| 3.2.2 NtWRKY-R1基因过表达及RNAi载体的构建 | 第17-20页 |
| 3.2.2.1 NtWRKY-R1基因的PCR克隆 | 第17-18页 |
| 3.2.2.2 克隆载体pMD~(TM)19-T-NtWRKY-R1及pMD~(TM)19-T-N-187的构建 | 第18页 |
| 3.2.2.3 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备 | 第18页 |
| 3.2.2.4 大肠杆菌(DH5α)转化 | 第18-19页 |
| 3.2.2.5 阳性转化子验证及测序 | 第19页 |
| 3.2.2.6 pS1300-NtWRKY-R1过表达载体的构建 | 第19-20页 |
| 3.2.2.7 NtWRKY-R1 RNAi载体的构建 | 第20页 |
| 3.2.3 NtWRKY-R1的过表达和RNAi载体及其启动子载体的瞬时表达 | 第20-21页 |
| 3.2.3.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备及转化 | 第20页 |
| 3.2.3.2 农杆菌介导转化 | 第20-21页 |
| 3.2.4 瞬时表达分析 | 第21-23页 |
| 3.2.4.1 pS1300-NtWRKY-R1、pFGC5941-NtWRKY-R1瞬时表达验证 | 第21页 |
| 3.2.4.2 GUS染色 | 第21页 |
| 3.2.4.3 GUS的定量测定 | 第21-23页 |
| 3.2.5 BY2细胞的遗传转化 | 第23-24页 |
| 3.2.5.1 BY2的准备 | 第23页 |
| 3.2.5.2 农杆菌培养及BY2遗传转化 | 第23页 |
| 3.2.5.3 BY2细胞转基因鉴定及分析 | 第23-24页 |
| 3.2.6 RACE法扩增NtWRKY-R1基因的UTR | 第24-25页 |
| 3.2.6.1 RT-PCR构建RACE cDNA文库 | 第24页 |
| 3.2.6.2 切胶回收目的基因 | 第24页 |
| 3.2.6.3 克隆载体的构建 | 第24页 |
| 3.2.6.4 阳性转化子验证及测序 | 第24-25页 |
| 3.2.7 NtWRKY-R1蛋白的原核表达载体的构建 | 第25页 |
| 3.2.7.1 NtWRKY-R1基因的克隆载体构建 | 第25页 |
| 3.2.7.2 克隆载体pMD~(TM)19-T-NtWRKY-R1的验证及测序 | 第25页 |
| 3.2.7.3 NtWRKY-R1基因的原核表达载体的构建 | 第25页 |
| 3.2.7.4 原核表达载体pET28a-NtWRKY-R1的验证及测序 | 第25页 |
| 3.2.8 NtWRKY-R1蛋白的表达 | 第25-27页 |
| 3.2.8.1 蛋白诱导 | 第25-26页 |
| 3.2.8.2 蛋白提取 | 第26页 |
| 3.2.8.3 目的蛋白的纯化 | 第26-27页 |
| 4 结果与分析 | 第27-44页 |
| 4.1 NtWRKY-R1真核表达载体的构建及其瞬时表达分析 | 第27-34页 |
| 4.1.1 烟草根尖总RNA提取分析 | 第27页 |
| 4.1.2 NtWRKY-R1过表达载体的构建 | 第27-29页 |
| 4.1.2.1 NtWRKY-R1基因的克隆 | 第27-28页 |
| 4.1.2.2 克隆载体NtWRKY-R1-T-pMD19~(TM)(simple)构建及检测 | 第28页 |
| 4.1.2.3 NtWRKY-R1的重组表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 4.1.3 NtWRKY-R1的RNAi载体构建 | 第29-31页 |
| 4.1.4 NtWRKY-R1的过表达和RNAi载体在叶肉细胞中的瞬时表达 | 第31-32页 |
| 4.1.5 NtWRKY-R1的过表达和RNAi载体与NtWRKY-R1启动子共表达分析 | 第32-34页 |
| 4.2 NtWRKY-R1过表达和RNAi载体分别转化稳定遗传NtWRKY-R1 promotor-GUS转基因BY2分析 | 第34-35页 |
| 4.3 烟草NtWRKY-R1基因全长克隆 | 第35-40页 |
| 4.3.1 NtWRKY-R1ORF的3'-UTR克隆 | 第35-37页 |
| 4.3.2 NtWRKY-R1 ORF的5'-UTR克隆 | 第37-40页 |
| 4.4 NtWRKY-R1蛋白纯化 | 第40-44页 |
| 4.4.1 NtWRKY-R1原核表达载体的构建及检测 | 第40页 |
| 4.4.2 SDS-PAGE电泳检测NtWRKY-R1蛋白 | 第40-42页 |
| 4.4.3 NtWRKY-R1蛋白的纯化 | 第42-44页 |
| 5 讨论 | 第44-46页 |
| 6 结论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| ABSTRACT | 第51-52页 |
