| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语表 | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第11-46页 |
| 1.1 CRISPR-Cas免疫系统的发现及其功能 | 第11-13页 |
| 1.2 CRISPR-Cas系统多样性及其分类 | 第13-16页 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统介导的病毒防御原理 | 第16-43页 |
| 1.3.1 新spacer的获取 | 第18-20页 |
| 1.3.2 CRISPR RNA加工 | 第20-25页 |
| 1.3.3 Ⅰ型Cascade介导依赖PAM识别的DNA干涉 | 第25-34页 |
| 1.3.4 Ⅱ型和Ⅲ-A亚型CRISPR-Cas系统介导的DNA干涉简介 | 第34-37页 |
| 1.3.5 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导RNA干涉 | 第37-43页 |
| 1.4 S islandicus Rey15A中CRISPR-Cas干涉系统 | 第43-45页 |
| 1.5 本研究目的 | 第45-46页 |
| 2 材料与方法 | 第46-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第46-49页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第46-48页 |
| 2.1.2 分子生物学实验材料 | 第48页 |
| 2.1.3 Sulfolous细胞培养 | 第48-49页 |
| 2.2 实验方法 | 第49-58页 |
| 2.2.1 Sulfolobus感受态制备及电转化 | 第49-50页 |
| 2.2.2 cas敲除质粒及cas缺失株的构建 | 第50-51页 |
| 2.2.3 cas互补质粒,DNA、RNA干涉质粒构建 | 第51-54页 |
| 2.2.4 Sulfolobus总RNA提取及Northern分析 | 第54-55页 |
| 2.2.5 cDNA合成,qPCR及RACE | 第55-56页 |
| 2.2.6 β-糖苷酶试验 | 第56-58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-76页 |
| 3.1 I-A亚型系统中Cas蛋白在pre-crRNA加工及PAM依赖型DNA干涉中功能的遗传学鉴定 | 第58-64页 |
| 3.1.1 cas缺失株的构建 | 第58-59页 |
| 3.1.2 对Cascis,Cmr-α和Cmr-β是否参与pre-crRNA加工和DNA干涉的确定 | 第59-61页 |
| 3.1.3 S islandicus Rey15A I-A亚型CRISPR-Cas系统中Cas6,Cas7,Cas5和Csa5蛋白功能分析 | 第61-63页 |
| 3.1.4 Cas3(解旋酶-核酸酶)在pre-crRNA加工及DNA干涉过程中的功能分析 | 第63-64页 |
| 3.2 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的RNA干涉的体内分析 | 第64-76页 |
| 3.2.1 S.islandicus内源CRISPR系统介导的RNA干涉活性研究 | 第64-67页 |
| 3.2.2 pAC质粒表达的crRNA对S.islandicus Rey15A中靶基因表达高效抑制作用的鉴定 | 第67-68页 |
| 3.2.3 S1 crRNA 3’端一个3nt序列对Cmr介导的体内RNA干涉重要性的确定 | 第68-71页 |
| 3.2.4 S.islandicus中Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的基因沉默分析 | 第71-72页 |
| 3.2.5 S.islandicus Cmr系统执行的RNA剪切特征的分析 | 第72-76页 |
| 4 讨论 | 第76-84页 |
| 4.1 关于S.islandicus I-A亚型Cascade的组装 | 第76-78页 |
| 4.2 关于S.islandicus CRISPR-Cmr系统介导的干涉复合体对靶RNA的识别 | 第78-79页 |
| 4.3 关于6亚基Cmr复合体组装样式和靶RNA切割特征 | 第79-81页 |
| 4.4 Cmr-α与Cmr-β能否相互转化? | 第81-82页 |
| 4.5 CRISPR-Cas系统的应用前景 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-97页 |
| 附录 | 第97-104页 |
| 附录1-本研究所用引物 | 第97-103页 |
| 附录2-Sulfobus培养基基础盐及维他命溶液配方 | 第103-104页 |
| 博士期间研究成果 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105页 |
