| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略词 | 第13-15页 |
| 文献综述 | 第15-23页 |
| 第一章 PRRSV N基因的扩增及其编码蛋白高免血清的制备 | 第23-51页 |
| 1 器材 | 第23-25页 |
| 1.1 主要材料 | 第23-24页 |
| 1.2 主要试剂 | 第24页 |
| 1.3 主要仪器 | 第24-25页 |
| 2 方法 | 第25-38页 |
| 2.1 引物设计 | 第25页 |
| 2.2 Marc145细胞的培养 | 第25-26页 |
| 2.2.1 冻存细胞的复苏与培养 | 第25-26页 |
| 2.2.2 细胞的冻存 | 第26页 |
| 2.3 PRRSV病毒的扩增 | 第26页 |
| 2.4 细胞总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.5 细胞总RNA的反转录 | 第27页 |
| 2.6 携带PRRSV N基因的原核表达载体的构建 | 第27-31页 |
| 2.6.1 目的片段的PCR扩增 | 第27-28页 |
| 2.6.2 目的片段纯化 | 第28页 |
| 2.6.3 酶切与连接 | 第28-29页 |
| 2.6.4 重组质粒转化 | 第29-30页 |
| 2.6.5 重组质粒的筛选 | 第30-31页 |
| 2.7 PRRSV E11105分离株N蛋白基因的生物信息学分析 | 第31-33页 |
| 2.7.1 参考N基因的毒株信息 | 第31-32页 |
| 2.7.2 PRRSV E11105分离株N基因核苷酸序列相似性比对分析 | 第32页 |
| 2.7.3 PRRSV E11105分离株N基因编码蛋白的氨基酸相似性及比对分析 | 第32页 |
| 2.7.4 PRRSV E11105分离株N基因系统进化树分析 | 第32页 |
| 2.7.5 PRRSV E11105分离株N基因编码的蛋白质二级结构预测 | 第32页 |
| 2.7.6 PRRSV E11105分离株N蛋白B细胞表位预测 | 第32页 |
| 2.7.7 PRRSV E11105分离株N蛋白结构域预测 | 第32-33页 |
| 2.7.8 PRRSV E11105分离株N蛋白跨膜结构预测 | 第33页 |
| 2.7.9 PRRSV E11105分离株N蛋白序列信号肽预测 | 第33页 |
| 2.8 重组蛋白的诱导表达与纯化 | 第33-36页 |
| 2.8.1 重组蛋白诱导表达与鉴定 | 第33-35页 |
| 2.8.2 重组蛋白的纯化与鉴定 | 第35-36页 |
| 2.8.3 蛋白透析 | 第36页 |
| 2.9 高免血清制备 | 第36-37页 |
| 2.9.1 重组蛋白浓度测定 | 第36页 |
| 2.9.2 动物免疫与血清收集 | 第36-37页 |
| 2.10 原核表达蛋白抗原性分析 | 第37-38页 |
| 2.10.1 ELISA分析及效价测定 | 第37页 |
| 2.10.2 高免血清的Western-bloting分析 | 第37-38页 |
| 3 结果 | 第38-49页 |
| 3.1 目的基因PCR扩增结果 | 第38页 |
| 3.2 重组质粒的双酶切鉴定结果 | 第38-39页 |
| 3.3 阳性重组质粒pCold I-N的测序结果 | 第39-40页 |
| 3.4 N基因及其编码蛋白的序列分析结果 | 第40-46页 |
| 3.4.1 N基因相似性比对分析结果 | 第40-41页 |
| 3.4.2 N基因系统进化树分析结果 | 第41-42页 |
| 3.4.3 N基因编码蛋白二级结构预测结果 | 第42-43页 |
| 3.4.4 N基因编码蛋白B细胞抗原表位预测结果 | 第43-44页 |
| 3.4.5 N基因编码蛋白的结构域预测结果 | 第44页 |
| 3.4.6 N基因编码蛋白的跨膜结构预测结果 | 第44-45页 |
| 3.4.7 N基因编码蛋白的信号肽预测结果 | 第45-46页 |
| 3.5 重组蛋白的验证 | 第46-47页 |
| 3.5.1 重组蛋白表达形式鉴定结果 | 第46页 |
| 3.5.2 重组表达蛋白的His标签Western blot检测结果 | 第46-47页 |
| 3.6 重组蛋白的纯化结果鉴定 | 第47-48页 |
| 3.7 原核表达的重组蛋白抗原性分析结果 | 第48-49页 |
| 3.7.1 ELISA分析结果 | 第48页 |
| 3.7.2 Western-bloting分析结果 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 4.1 关于PRRSV N蛋白 | 第49-50页 |
| 4.2 关于重组蛋白的可溶性 | 第50-51页 |
| 第二章 P-Body组件蛋白DCP2基因的扩增及高免血清的制备 | 第51-77页 |
| 1 器材 | 第52页 |
| 1.1 主要材料 | 第52页 |
| 1.2 主要试剂 | 第52页 |
| 1.3 主要仪器 | 第52页 |
| 2 方法 | 第52-60页 |
| 2.1 引物设计 | 第53页 |
| 2.2 Marc145细胞的培养 | 第53页 |
| 2.3 细胞总RNA的提取 | 第53页 |
| 2.4 细胞总RNA的反转录 | 第53页 |
| 2.5 DCP2克隆质粒的的构建 | 第53-55页 |
| 2.5.1 目的片段的PCR扩增 | 第53-54页 |
| 2.5.2 目的片段纯化 | 第54页 |
| 2.5.3 目的片段的连接转化 | 第54页 |
| 2.5.4 重组质粒的筛选及序列测定 | 第54-55页 |
| 2.6 Marc145细胞源DCP2基因的生物信息学分析 | 第55-56页 |
| 2.6.1 参考DCP2基因的信息 | 第55页 |
| 2.6.2 Marc145细胞源DCP2基因核苷酸序列相似性比对分析 | 第55-56页 |
| 2.6.3 Marc145细胞源DCP2基因编码蛋白的氨基酸相似性及比对分析 | 第56页 |
| 2.6.4 Marc145细胞源DCP2基因系统进化树分析 | 第56页 |
| 2.6.5 Marc145细胞源DCP2基因编码的蛋白质二级结构预测 | 第56页 |
| 2.6.6 Marc145细胞源DCP2蛋白B细胞表位预测 | 第56页 |
| 2.6.7 Marc145细胞源DCP2蛋白结构域预测 | 第56页 |
| 2.6.8 Marc145细胞源DCP2蛋白跨膜结构预测 | 第56页 |
| 2.6.9 Marc145细胞源DCP2蛋白序列信号肽预测 | 第56页 |
| 2.7 携带Marc145细胞源DCP2基因的原核表达载体的构建 | 第56-58页 |
| 2.7.1 目的片段的PCR扩增 | 第56-57页 |
| 2.7.2 目的片段纯化 | 第57页 |
| 2.7.3 酶切与连接 | 第57-58页 |
| 2.7.4 重组质粒转化 | 第58页 |
| 2.7.5 重组质粒的筛选 | 第58页 |
| 2.8 重组蛋白的诱导表达与纯化 | 第58-60页 |
| 2.8.1 重组蛋白诱导表达与鉴定 | 第58-59页 |
| 2.8.2 重组蛋白的纯化与鉴定 | 第59-60页 |
| 2.8.3 蛋白透析 | 第60页 |
| 2.9 高免血清制备 | 第60页 |
| 2.9.1 重组蛋白浓度测定 | 第60页 |
| 2.9.2 动物免疫与血清收集 | 第60页 |
| 2.10 原核表达蛋白抗原性分析 | 第60页 |
| 2.10.1 ELISA分析及效价测定 | 第60页 |
| 2.10.2 高免血清的Western-bloting分析 | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-74页 |
| 3.1 目的基因PCR扩增结果 | 第60-61页 |
| 3.2 阳性重组克隆质粒的测序结果 | 第61-64页 |
| 3.4 DCP2基因及其编码蛋白的氨基酸序列分析 | 第64-71页 |
| 3.4.1 Marc145细胞源DCP2 X1、X2亚型氨基酸序列比对结果 | 第64页 |
| 3.4.1 DCP2 X1亚型核酸及氨基酸序列相似性比对分析结果 | 第64-65页 |
| 3.4.2 DCP2 X1亚型基因系统进化树分析结果 | 第65-66页 |
| 3.4.3 DCP2 X1亚型基因编码蛋白二级结构预测结果 | 第66-67页 |
| 3.4.4 DCP2 X1亚型基因编码蛋白B细胞抗原表位预测结果 | 第67-68页 |
| 3.4.5 DCP2 X1亚型基因编码蛋白的结构域预测结果 | 第68-69页 |
| 3.4.6 DCP2 X1亚型基因编码蛋白的跨膜结构预测结果 | 第69页 |
| 3.4.7 DCP2 X1亚型基因编码蛋白的信号肽预测结果 | 第69-70页 |
| 3.4.8 DCP2 X1亚型基因扩增及其重组原核表达质粒的双酶切鉴定结果 | 第70-71页 |
| 3.5 DCP2 X1亚型重组蛋白的验证 | 第71-73页 |
| 3.5.1 DCP2 X1亚型重组蛋白表达形式鉴定结果 | 第71-72页 |
| 3.5.2 DCP2 X1亚型重组表达蛋白的His标签Western blot检测结果 | 第72-73页 |
| 3.6 DCP2 X1亚型重组蛋白的纯化结果鉴定结果 | 第73-74页 |
| 3.7 DCP2 X1亚型原核表达重组蛋白抗原性分析结果 | 第74页 |
| 3.7.1 ELISA分析结果 | 第74页 |
| 3.7.2 Western-bloting分析结果 | 第74页 |
| 4 讨论 | 第74-77页 |
| 4.1 关于DCP2蛋白 | 第74-75页 |
| 4.2 关于转录变异体 | 第75-77页 |
| 第三章 P-Body组件蛋白LSm1基因的扩增及原核表达质粒的构建 | 第77-93页 |
| 1 器材 | 第78-79页 |
| 1.1 主要材料 | 第78页 |
| 1.2 主要试剂 | 第78-79页 |
| 1.3 主要仪器 | 第79页 |
| 2 方法 | 第79-84页 |
| 2.1 引物设计 | 第79页 |
| 2.2 Marc145细胞的培养 | 第79页 |
| 2.3 细胞总RNA的提取 | 第79页 |
| 2.4 细胞总RNA的反转录 | 第79页 |
| 2.5 携带Marc145细胞源LSm1基因的原核表达载体的构建 | 第79-82页 |
| 2.5.1 目的片段的巢式PCR扩增 | 第79-80页 |
| 2.5.2 目的片段纯化 | 第80-81页 |
| 2.5.3 酶切与连接 | 第81页 |
| 2.5.4 重组质粒转化 | 第81-82页 |
| 2.5.5 重组质粒的筛选 | 第82页 |
| 2.6 Marc145细胞源LSm1基因的生物信息学分析 | 第82-83页 |
| 2.6.1 参考LSm1基因的信息 | 第82页 |
| 2.6.2 Marc145细胞源LSm1基因核苷酸序列相似性比对分析 | 第82-83页 |
| 2.6.3 Marc145细胞源LSm1基因编码蛋白的氨基酸相似性及比对分析 | 第83页 |
| 2.6.4 Marc145细胞源LSm1基因系统进化树分析 | 第83页 |
| 2.6.5 Marc145细胞源LSm1基因编码的蛋白质二级结构预测 | 第83页 |
| 2.6.6 Marc145细胞源LSm1蛋白B细胞表位预测 | 第83页 |
| 2.6.7 Marc145细胞源LSm1蛋白结构域预测 | 第83页 |
| 2.6.8 Marc145细胞源LSm1蛋白跨膜结构预测 | 第83页 |
| 2.6.9 Marc145细胞源LSm1蛋白序列信号肽预测 | 第83页 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达与纯化 | 第83-84页 |
| 2.7.1 阳性重组质粒转入表达菌BL21 | 第83-84页 |
| 2.7.2 重组蛋白的纯化与鉴定 | 第84页 |
| 3 结果 | 第84-91页 |
| 3.0 LSm1的巢式PCR扩增结果 | 第84页 |
| 3.1 重组质粒的双酶切验证 | 第84-85页 |
| 3.2 LSm1的序列测定结果 | 第85页 |
| 3.3 LSm1基因序列的相似性分析结果 | 第85-86页 |
| 3.4 LSm1基因序列编码氨基酸的相似性分析结果 | 第86-87页 |
| 3.5 LSm1基因序列的遗传进化树分析结果 | 第87页 |
| 3.6 LSm1基因编码蛋白二级结构预测结果 | 第87-88页 |
| 3.7 LSm1基因编码蛋白B细胞多参数分析结果 | 第88-89页 |
| 3.8 LSm1基因编码蛋白保守结构域预测结果 | 第89页 |
| 3.9 LSm1基因编码蛋白的跨膜结构预测结果 | 第89-90页 |
| 3.10 LSm1基因编码蛋白信号肽预测结果 | 第90页 |
| 3.11 LSm1重组蛋白的表达及纯化结果鉴定 | 第90-91页 |
| 4 讨论 | 第91-93页 |
| 4.1 关于LSm1基因及蛋白 | 第91-92页 |
| 4.2 关于重组蛋白不表达或表达量低的原因 | 第92-93页 |
| 第四章 PRRSV复制对宿主LSm1、DCP2基因转录水平的影响 | 第93-102页 |
| 1 器材 | 第93-94页 |
| 1.1 主要材料 | 第93页 |
| 1.2 主要试剂 | 第93-94页 |
| 1.3 主要仪器 | 第94页 |
| 2 方法 | 第94-96页 |
| 2.1 引物设计 | 第94页 |
| 2.2 Marc145细胞的培养 | 第94-95页 |
| 2.3 PRRSV病毒的扩增 | 第95页 |
| 2.4 病毒TCID50的测定 | 第95页 |
| 2.5 感染病毒不同时间段细胞的收集 | 第95页 |
| 2.6 细胞总RNA的提取 | 第95页 |
| 2.7 反转录 | 第95-96页 |
| 2.8 引物特异性的普通PCR验证 | 第96页 |
| 2.9 不同时间段LSm1、DCP2、N基因转录水平的检测 | 第96页 |
| 3 结果 | 第96-100页 |
| 3.1 细胞CPE | 第96-97页 |
| 3.2 PRRSV TCID_(50)的测定结果 | 第97-98页 |
| 3.3 qPCR引物的普通PCR扩增结果 | 第98页 |
| 3.4 PRRSV对DCP2、LSm1转录水平的影响结果 | 第98-100页 |
| 4 讨论 | 第100-102页 |
| 4.1 P-Body对病毒复制的影响 | 第100-101页 |
| 4.2 实时荧光定量PCR技术 | 第101-102页 |
| 全文结论 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-112页 |
| 附录一 发表文章 | 第112-113页 |
| 附录二 各种培养基、溶液及试剂的配制 | 第113-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
