| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 第一章 文献综述 | 第8-20页 |
| 1 植物雄性不育性研究 | 第8-10页 |
| 1.1 细胞核雄性不育(GMS)相关基因研究 | 第8-9页 |
| 1.2 细胞质雄性不育(CMS)相关基因研究 | 第9页 |
| 1.3 orf25基因研究现状 | 第9-10页 |
| 1.4 atp9基因研究现状 | 第10页 |
| 2 RNA干扰技术及其在烟草中的应用研究 | 第10-14页 |
| 2.1 RNA干扰的作用机制 | 第11页 |
| 2.2 RNA干扰的特点 | 第11-12页 |
| 2.3 RNA干扰技术在烟草中的应用 | 第12-14页 |
| 2.3.1 RNA干扰技术在烟草基因功能研究中的应用 | 第12页 |
| 2.3.2 RNA干扰技术在烟草抗病研究中的应用 | 第12-13页 |
| 2.3.3 RNA干扰技术在烟草虫害防治研究中的应用 | 第13-14页 |
| 2.3.4 RNA干扰技术在烟草品质改良研究中的应用 | 第14页 |
| 3 烟草遗传转化技术 | 第14-18页 |
| 3.1 植物基因工程的现状 | 第14-15页 |
| 3.2 植物基因工程的前景 | 第15页 |
| 3.3 农杆菌介导烟草遗传转化法 | 第15-17页 |
| 3.4 DNA直接导入烟草法 | 第17页 |
| 3.5 基因枪法 | 第17页 |
| 3.6 电击法 | 第17页 |
| 3.7 花粉管通道法 | 第17-18页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第18页 |
| 5 研究内容和技术路线 | 第18-20页 |
| 第二章 材料与方法 | 第20-31页 |
| 1 实验材料 | 第20-22页 |
| 1.1 植物材料 | 第20页 |
| 1.2 菌株和质粒 | 第20页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第20页 |
| 1.4 主要实验试剂 | 第20页 |
| 1.5 培养基以及抗生素的配置 | 第20-22页 |
| 2 实验方法 | 第22-31页 |
| 2.1 烟草orf25、atp9基因RNAi载体构建 | 第22-27页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第22页 |
| 2.1.2 目的基因干扰片段的扩增及回收 | 第22-23页 |
| 2.1.3 连接T载体 | 第23-24页 |
| 2.1.4 构建pET30a-orf25(+)、pET30a-atp9(+) | 第24-25页 |
| 2.1.5 构建pET30a-orf25(+)-linker、pET30a-atp9(+)-linker | 第25-26页 |
| 2.1.6 构建pET30a-orf25(+)-linker-orf25(-) | 第26页 |
| 2.1.7 构建pET30a-atp9(+)-linker-atp9(-) | 第26页 |
| 2.1.8 构建pCAMBIA1301-orf25-RNAi、pCAMBIA1301-atp9-RNAi | 第26-27页 |
| 2.2 RNAi表达载体转化农杆菌 | 第27-28页 |
| 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 2.2.2 质粒DNA直接导入农杆菌 | 第27-28页 |
| 2.2.3 农杆菌转化子的鉴定 | 第28页 |
| 2.3 农杆菌介导烟草遗传转化体系的构建及优化 | 第28-30页 |
| 2.3.1 叶盘法转化烟草 | 第28-29页 |
| 2.3.2 外植体预培养时间的确定 | 第29页 |
| 2.3.3 卡那霉素浓度的筛选 | 第29页 |
| 2.3.4 菌液浓度及侵染时间的确定 | 第29页 |
| 2.3.5 共培养时间的确定 | 第29页 |
| 2.3.6 头孢霉素浓度的筛选 | 第29页 |
| 2.3.7 转基因烟草植株的获得 | 第29-30页 |
| 2.4 转基因烟草植株的检测 | 第30-31页 |
| 第三章 结果与分析 | 第31-44页 |
| 1 orf25、atp9基因RNAi载体构建 | 第31-36页 |
| 1.1 基因片段的PCR扩增 | 第31页 |
| 1.2 pET30a-orf25(+)、pET30a-atp9(+)的构建及鉴定 | 第31-32页 |
| 1.3 pET30a-orf25(+)-linker、pET30a-atp9(+)-linker的构建及鉴定 | 第32-33页 |
| 1.4 pET30a-orf25(+)-linker-orf25(-)的构建及鉴定 | 第33-34页 |
| 1.5 pET30a-atp9(+)-linker-atp9(-)的构建及鉴定 | 第34页 |
| 1.6 pCAMBIA1301-orf25-RNAi的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| 1.7 pCAMBIA1301-atp9-RNAi的构建及鉴定 | 第35-36页 |
| 2 RNAi表达载体转化农杆菌的鉴定 | 第36-37页 |
| 3 烟草遗传转化体系的优化 | 第37-40页 |
| 3.1 外植体预培养时间的确定 | 第37页 |
| 3.2 卡那霉素浓度的筛选 | 第37-38页 |
| 3.3 菌液浓度及侵染时间的确定 | 第38-39页 |
| 3.4 共培养时间的确定 | 第39-40页 |
| 3.5 头孢霉素浓度的筛选 | 第40页 |
| 4 转基因烟草植株的获得 | 第40-41页 |
| 5 转基因烟草PCR检测 | 第41-44页 |
| 结论 | 第44-45页 |
| 讨论 | 第45-48页 |
| 1 RNA干扰载体的构建 | 第45页 |
| 2 根癌农杆菌介导烟草遗传转化 | 第45-46页 |
| 2.1 卡那霉素筛选浓度的确定 | 第45-46页 |
| 2.2 烟草叶片的选择 | 第46页 |
| 2.3 农杆菌的抑制 | 第46页 |
| 3 下一步的研究设想 | 第46-48页 |
| 参考文献 | 第48-56页 |
| 致谢 | 第56页 |
