| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 引言 猪传染性胃肠炎病毒及其反向遗传操作技术研究进展 | 第19-40页 |
| 1.1 TGEV的分类地位 | 第19-20页 |
| 1.2 TGEV的形态结构 | 第20-21页 |
| 1.3 TGEV的基因组结构及功能 | 第21-27页 |
| 1.3.1 冠状病毒基因组的共有特征 | 第21-23页 |
| 1.3.2 冠状病毒复制的顺式作用元件 | 第23-27页 |
| 1.3.2.1 5’UTR和基因组复制前的翻译步骤 | 第23-24页 |
| 1.3.2.2 在ORF1a/1b之间-1 核糖体移码所依赖的假结结构和转移序列 | 第24-25页 |
| 1.3.2.3 复制复合体中与膜相关的RNA元件 | 第25页 |
| 1.3.2.4 5’和3’邻近的RNA元件 | 第25-27页 |
| 1.3.2.5 RNA复制的中间作用信号 | 第27页 |
| 1.4 猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的繁殖与复制 | 第27-29页 |
| 1.4.1 与细胞受体结合 | 第27页 |
| 1.4.2 病毒蛋白的合成与基因组的复制 | 第27-28页 |
| 1.4.3 病毒的组装与释放 | 第28-29页 |
| 1.5 RNA病毒的反向遗传操作技术 | 第29-34页 |
| 1.5.1 RNA病毒的生物学特性和反向遗传感染性克隆的构建策略 | 第29-31页 |
| 1.5.2 正股RNA病毒的生物学特性、反向遗传技术及疫苗设计 | 第31-34页 |
| 1.5.2.1 小RNA病毒：小儿麻痹症病毒和鼻病毒 | 第32页 |
| 1.5.2.2 冠状病毒 | 第32-33页 |
| 1.5.2.3 黄病毒：黄热病、登革热和西尼亚病毒病 | 第33-34页 |
| 1.6 猪传染性胃肠炎病毒反向遗传操作策略 | 第34-40页 |
| 1.6.1 冠状病毒I型的致病机理 | 第35-36页 |
| 1.6.2 冠状病毒基因组的生成 | 第36页 |
| 1.6.3 TGEV复制的必需基因 | 第36-37页 |
| 1.6.4 转录调控序列 | 第37-38页 |
| 1.6.5 病毒的拯救 | 第38-40页 |
| 1.6.5.1 体内转录拯救病毒 | 第38页 |
| 1.6.5.2 体外转录拯救病毒 | 第38-40页 |
| 第二章 TGEV强毒株AH和弱毒株H165的全基因组序列分析 | 第40-59页 |
| 2.1 材料与方法 | 第41-46页 |
| 2.1.1 病毒株和细胞系 | 第41页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第41-42页 |
| 2.1.3 引物设计与合成 | 第42页 |
| 2.1.4 病毒扩增及RNA提取 | 第42页 |
| 2.1.5 RT-PCR方法的建立 | 第42页 |
| 2.1.6 PCR产物的切胶回收 | 第42-43页 |
| 2.1.7 PCR产物连接与转化 | 第43页 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定及序列测定 | 第43-44页 |
| 2.1.9 5’RACE扩增基因组的 5’UTR片段 | 第44-45页 |
| 2.1.10 3’RACE扩增基因组的 3’UTR片段 | 第45页 |
| 2.1.11 序列分析 | 第45-46页 |
| 2.2 结果 | 第46-56页 |
| 2.2.1 TGEV全基因组分段扩增 | 第46-48页 |
| 2.2.2 TGEV全基因组、结构和非结构基因进化树的构建分析 | 第48-54页 |
| 2.2.2.1 TGEV全基因组进化树构建 | 第48页 |
| 2.2.2.2 TGEV的S基因所编码氨基酸的进化树构建分析 | 第48-49页 |
| 2.2.2.3 TGEV的E基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第49-50页 |
| 2.2.2.4 TGEV的M基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第50页 |
| 2.2.2.5 TGEV的N基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第50-51页 |
| 2.2.2.6 TGEV的ORF1a基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第51-52页 |
| 2.2.2.7 TGEV的ORF1b基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第52页 |
| 2.2.2.8 TGEV的ORF3a基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第52-53页 |
| 2.2.2.9 TGEV的ORF3b基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第53-54页 |
| 2.2.2.10 TGEV的ORF7基因所编码氨基酸的进化树构建 | 第54页 |
| 2.2.3 TGEV强弱毒株各基因氨基酸差异分析 | 第54-55页 |
| 2.2.4 TGEV强毒株AH、弱毒疫苗株H165及PUR46-MAD转录调控序列分析 | 第55-56页 |
| 2.3 讨论 | 第56-59页 |
| 第三章 TGEV强毒株AH和弱毒疫苗株H165的全长质粒的构建 | 第59-99页 |
| 3.1 材料和方法 | 第60-78页 |
| 3.1.1 细胞、病毒、载体、感受态细胞 | 第60页 |
| 3.1.2 主要试剂及试验材料 | 第60-61页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第61页 |
| 3.1.4 pBeloBAC ll载体和AH-P5病毒基因组限制性内切酶的分析及选择 | 第61页 |
| 3.1.5 pBAC-TGEV(AH)-FL全长质粒构建策略的设计 | 第61页 |
| 3.1.6 pBAC-AH-MCS多克隆质粒的构建 | 第61-65页 |
| 3.1.6.1 BAC载体片段和原始D片段的PCR扩增 | 第62页 |
| 3.1.6.2 BAC载体片段和原始D片段PCR产物的切胶、纯化 | 第62-63页 |
| 3.1.6.3 BAC载体片段和原始D片段PCR产物的酶切 | 第63-64页 |
| 3.1.6.4 连接反应 | 第64页 |
| 3.1.6.5 转化反应 | 第64页 |
| 3.1.6.6 菌液PCR筛选阳性克隆 | 第64-65页 |
| 3.1.6.7 阳性克隆进行测序分析 | 第65页 |
| 3.1.7 AH-A/5’片段插入到pBAC-AH-MCS中 | 第65-68页 |
| 3.1.7.1 引物设计 | 第65页 |
| 3.1.7.2 片段扩增 | 第65-67页 |
| 3.1.7.3 酶切、连接、转化 | 第67-68页 |
| 3.1.7.4 菌液PCR筛选阳性克隆 | 第68页 |
| 3.1.8 AH-B(△ClaI)片段插入到pBAC-TGEV(AH)-A中 | 第68-71页 |
| 3.1.8.1 引物设计 | 第68-69页 |
| 3.1.8.2 片段扩增 | 第69页 |
| 3.1.8.3 酶切、连接、转化 | 第69-70页 |
| 3.1.8.4 菌液PCR筛选阳性克隆 | 第70-71页 |
| 3.1.9 AH-C片段插入到pBAC-TGEV(AH)-AB(△ClaI)中 | 第71-74页 |
| 3.1.9.1 引物设计 | 第71页 |
| 3.1.9.2 片段扩增 | 第71-72页 |
| 3.1.9.3 酶切、连接、转化 | 第72-73页 |
| 3.1.9.4 菌液PCR筛选阳性克隆 | 第73-74页 |
| 3.1.10 AH株 3’段体外构建及插入到pBAC-TGEV(AH)-ABC(△ClaI)中 | 第74-75页 |
| 3.1.10.1 体外构建方案设计 | 第74页 |
| 3.1.10.2 化学合成pOK3’-3 | 第74-75页 |
| 3.1.10.3 引物设计及 3’-1 片段和 3’-2 片段顺次插入 | 第75页 |
| 3.1.10.4 酶切、连接、转化 | 第75页 |
| 3.1.11 含毒性序列的△Cla I片段（4418-9616）的最后插入 | 第75-77页 |
| 3.1.11.1 毒性片段△ClaI（4418-9616）单独克隆到pBAC载体中 | 第75-76页 |
| 3.1.11.2 pBAC-TGEV(AH)-ABC3’(△ClaI)的大量制备 | 第76页 |
| 3.1.11.3 △ClaI片段（4418-9616）最后插入到pBAC-TGEV(AH)-ABC3’(△ClaI)中 | 第76-77页 |
| 3.1.12 中国经典疫苗毒株H165全长质粒的构建 | 第77页 |
| 3.1.13 全长质粒的质量及稳定性分析 | 第77页 |
| 3.1.14 含报告基因GFP的全长质粒的构建 | 第77-78页 |
| 3.2 结果 | 第78-94页 |
| 3.2.1 pBeloBAC ll载体和AH-P5病毒基因组限制性内切酶的分析及选择 | 第78-79页 |
| 3.2.2 pBAC-TGEV(AH)-FL全长质粒构建策略的确定 | 第79-81页 |
| 3.2.3 pBAC-AH-MCS多克隆质粒的构建 | 第81-83页 |
| 3.2.3.1 BAC载体和原始D片段的PCR扩增结果 | 第81-82页 |
| 3.2.3.2 p BAC-AH-MCS阳性克隆的筛选 | 第82-83页 |
| 3.2.3.3 三个疑似阳性的克隆（D8、D18、D20）的测序分析 | 第83页 |
| 3.2.4 pBAC-TGEV(AH)-A/5’的构建 | 第83-84页 |
| 3.2.4.1 片段制备 | 第83-84页 |
| 3.2.4.2 p BAC-TGEV(AH)-A阳性克隆的鉴定结果 | 第84页 |
| 3.2.5 p BAC-TGEV(AH)-AB(△ClaI)的构建 | 第84-86页 |
| 3.2.5.1 片段制备 | 第84-85页 |
| 3.2.5.2 p BAC-TGEV(AH)-AB(△ClaI)阳性克隆的鉴定结果 | 第85-86页 |
| 3.2.6 pBAC-TGEV(AH)-ABC(△ClaI)的构建 | 第86-87页 |
| 3.2.6.1 片段制备 | 第86页 |
| 3.2.6.2 pBAC-TGEV(AH)-ABC(△ClaI)阳性克隆的鉴定结果 | 第86-87页 |
| 3.2.7 p BAC-TGEV(AH)-ABC3’的构建 | 第87-88页 |
| 3.2.7.1 片段制备 | 第87-88页 |
| 3.2.7.2 pBAC-TGEV(AH)-ABC3’(△ClaI)阳性克隆的鉴定结果 | 第88页 |
| 3.2.8 △ClaI片段（4418-9616）最后插入到pBAC-TGEV(AH)-ABC3’(△ClaI)中 | 第88-90页 |
| 3.2.8.1 pBAC-△ClaI（4418-9616）的构建 | 第88-89页 |
| 3.2.8.2 pBAC-TGEV(AH)-FL鉴定 | 第89-90页 |
| 3.2.9 中国经典疫苗毒株H165全长质粒pBAC-TGEV(H165)-FL的构建 | 第90页 |
| 3.2.10 全长质粒的质量及稳定性分析 | 第90-92页 |
| 3.2.10.1 全长质粒质量分析 | 第90-91页 |
| 3.2.10.2 全长质粒稳定性分析 | 第91-92页 |
| 3.2.11 含报告基因GFP的全长质粒的构建 | 第92-94页 |
| 3.2.11.1 AH株 3-2 片段的构建 | 第92-93页 |
| 3.2.11.2 GFP基因插入的具体位置 | 第93页 |
| 3.2.11.3 含GFP基因的质粒的命名及示意图 | 第93-94页 |
| 3.3 讨论 | 第94-99页 |
| 第四章 TGEV强毒株AH和弱毒疫苗株H165及其报告病毒的拯救 | 第99-115页 |
| 4.1 材料和方法 | 第100-104页 |
| 4.1.1 细胞、病毒、质粒 | 第100页 |
| 4.1.2 主要试剂及试验材料 | 第100页 |
| 4.1.3 病毒拯救试验 | 第100-102页 |
| 4.1.4 拯救病毒株的RT-PCR鉴定 | 第102页 |
| 4.1.5 拯救病毒株的细胞病变效应（CPE）和间接免疫荧光（IFA）试验 | 第102页 |
| 4.1.6 拯救病毒株分子标签检测 | 第102-103页 |
| 4.1.7 拯救病毒株的电镜检测 | 第103页 |
| 4.1.8 拯救毒株不同代次病毒滴度测定 | 第103页 |
| 4.1.9 病毒一步生长曲线的测定 | 第103-104页 |
| 4.1.10 拯救毒株的全基因组测序 | 第104页 |
| 4.1.11 病毒拯救重复性试验 | 第104页 |
| 4.1.12 带GFP基因的报告病毒的拯救 | 第104页 |
| 4.2 结果 | 第104-113页 |
| 4.2.1 拯救毒株的RT-PCR鉴定 | 第104-105页 |
| 4.2.2 拯救病毒株细胞病变效应（CPE）和间接免疫荧光（IFA）试验 | 第105-107页 |
| 4.2.3 拯救毒株的分子标签检测 | 第107页 |
| 4.2.4 拯救毒株的电镜观察 | 第107-109页 |
| 4.2.5 拯救毒株不同代次病毒滴度测定 | 第109页 |
| 4.2.6 病毒一步生长曲线测定 | 第109-111页 |
| 4.2.7 拯救病毒株全基因组测序 | 第111页 |
| 4.2.8 病毒拯救的可重复性 | 第111页 |
| 4.2.9 带GFP标签的报告病毒的拯救 | 第111-113页 |
| 4.3 讨论 | 第113-115页 |
| 全文结论 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-128页 |
| 致谢 | 第128-130页 |
| 作者简历 | 第130页 |
