| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 引言 | 第11-19页 |
| 第一部分 小RNA分子vsRNA1755的生物学性质研究 | 第19-48页 |
| 一、实验材料 | 第20-23页 |
| 1. 细胞系和毒株 | 第20-21页 |
| 2. 主要试剂及耗材 | 第21-23页 |
| 3. 主要仪器 | 第23页 |
| 二、实验方法 | 第23-34页 |
| (一) vsRNA1755分子表达水平检测 | 第23-26页 |
| 1. 轮状病毒Wa株感染MA104、HT-29、Caco-2细胞,检测vsRNA1755 | 第23-26页 |
| 2. 轮状病毒ZTR68株感染MA104、HT-29、Caco-2细胞,检测vsRNA1755表达水平 | 第26页 |
| 3. 轮状病毒不同基因型感染MA104细胞,检测vsRNA1755 | 第26页 |
| 4. 轮状病毒ZTR68株感染MA104细胞不同时间段,检测vsRNA1755 | 第26页 |
| 5. 轮状病毒ZTR68株不同病毒MOI感染MA104细胞,检测vsRNA1755 | 第26页 |
| (二) vsRNA1755分子来源确认研究 | 第26-28页 |
| 1. vsRNA1755分子结构预测 | 第27页 |
| 2. BLAST比对分析vsRNA1755分子序列 | 第27页 |
| 3. 体外转染NSP4基因及其检测 | 第27-28页 |
| (三) vsRNA1755分子结构特征研究 | 第28-31页 |
| 1. 体外克隆vsRNA1755的前体茎环结构 | 第28-30页 |
| 2. 体外转染含前体茎环序列的质粒进MA104细胞,qRT-PCR检测vsRNA1755 | 第30页 |
| 3. Northern blot检测vsRNA1755 | 第30-31页 |
| (四) vsRNA1755分子合成途径研究 | 第31-34页 |
| 1. 下调宿主细胞中Drosha、Dicer1、Dicer2、AGO1、AGO2表达水平 | 第31-32页 |
| 2. qRT-PCR检测下调效果 | 第32-33页 |
| 3. Western blot检测下调效果 | 第33页 |
| 4. vsRNA1755分子合成途径检测 | 第33-34页 |
| 三、实验结果 | 第34-45页 |
| 1. vsRNA1755分子表达水平检测 | 第34-37页 |
| 2. vsRNA1755分子来源确认研究 | 第37-41页 |
| 3. vsRNA1755分子结构特征研究 | 第41-43页 |
| 4. vsRNA1755分子合成途径研究 | 第43-45页 |
| 四、讨论 | 第45-47页 |
| 五、小结 | 第47-48页 |
| 第二部分 vsRNA1755分子与靶基因关系的确定 | 第48-60页 |
| 一、实验材料 | 第49-51页 |
| 1. 细胞系和毒株 | 第49页 |
| 2. 主要试剂及耗材 | 第49-50页 |
| 3. 主要仪器 | 第50-51页 |
| 二、实验方法 | 第51-53页 |
| (一) 通过miRanda软件预测vsRNA1755分子的靶基因 | 第51页 |
| (二) 双荧光素酶报告系统检测验证vsRNA1755与IGF1R之间的靶定关系 | 第51-52页 |
| 1. 质粒转染细胞 | 第51页 |
| 2. 双报告基因检测 | 第51-52页 |
| 3. 统计学分析 | 第52页 |
| (三) 体外转染vsRNA1755模拟物和抑制物,检测宿主细胞IGF1R基因表达 | 第52-53页 |
| 三、实验结果 | 第53-57页 |
| 1. 通过miRanda软件预测vsRNA1755分子的靶基因 | 第53-55页 |
| 2. 双荧光素酶报告系统验证vsRNA1755与IGF1R的靶定关系 | 第55-56页 |
| 3. 体外转染vsRNA1755分子的mimics和inhibitor,qRT-PCR检测宿主细胞基因IGF1R的表达水平变化 | 第56-57页 |
| 4. 体外转染vsRNA1755分子的mimics和inhibitor,通过Western blot检测宿主细胞基因IGF1R的表达水平变化 | 第57页 |
| 四、讨论 | 第57-59页 |
| 五、小结 | 第59-60页 |
| 第三部分 vsRNA1755分子通过靶基因IGF1R激活自噬调控病毒增殖 | 第60-89页 |
| 一、实验材料 | 第60-63页 |
| 1. 细胞系和毒株 | 第60-61页 |
| 2. 主要试剂及耗材 | 第61-62页 |
| 3. 主要仪器 | 第62-63页 |
| 二、实验方法 | 第63-69页 |
| (一) 轮状病毒感染激活宿主细胞自噬 | 第63-66页 |
| 1. 用轮状病毒感染MA104细胞,于感染后2h、4h、6h检测细胞自噬 | 第63-64页 |
| 2. 用轮状病毒不同MOI感染MA104细胞,于病毒感染4h后检测细胞自噬 | 第64页 |
| 3. 用pEGFP-LC3B融合质粒检测细胞自噬标志物LC3B蛋白的点状聚集现象 | 第64页 |
| 4. 免疫荧光实验检测轮状病毒和LC3B共定位 | 第64页 |
| 5. 透射电镜观察轮状病毒感染后细胞自噬情况 | 第64-65页 |
| 6. 抑制自噬通路,检测轮状病毒基因组拷贝数变化 | 第65-66页 |
| (二) vsRNA1755激活宿主细胞自噬 | 第66-67页 |
| 1. 体外转染vsRNA1755分子的模拟物(mimics),用细胞自噬试剂盒检测自噬流 | 第66页 |
| 2. 基因水平检测vsRNA1755激活细胞自噬 | 第66-67页 |
| 3. 蛋白水平验证vsRNA1755激活细胞自噬 | 第67页 |
| (三) vsRNA1755在轮状病毒感染过程中的调控机制 | 第67-69页 |
| 1. 轮状病毒感染宿主细胞后检测IGF1R表达水平 | 第67-68页 |
| 2. 轮状病毒感染宿主细胞后检测pAkt、pmTOR表达水平 | 第68页 |
| 3. PI3K/Akt信号通路对病毒复制影响 | 第68页 |
| 4. vsRNA1755调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对病毒复制影响 | 第68-69页 |
| 三、实验结果 | 第69-86页 |
| (一) 轮状病毒感染激活宿主细胞自噬 | 第69-78页 |
| 1. 用轮状病毒感染MA104细胞,于感染后不同时间(2h、4h、6h)检测细胞自噬 | 第69-70页 |
| 2. 用轮状病毒不同MOI感染MA104细胞,于病毒感染4h后检测细胞自噬 | 第70-71页 |
| 3. pEGFP-LC3B融合质粒检测细胞自噬标志物LC3B蛋白 | 第71-72页 |
| 4. 免疫荧光检测轮状病毒和LC3B共定位 | 第72-73页 |
| 5. 透射电镜观察轮状病毒感染后细胞自噬情况 | 第73-74页 |
| 6. 抑制自噬通路,检测轮状病毒基因组拷贝数变化 | 第74-78页 |
| (二) vsRNA1755激活宿主细胞自噬 | 第78-81页 |
| 1. 体外转染vsRNA1755分子的模拟物(mimics),用细胞自噬试剂盒检测自噬流 | 第78-79页 |
| 2. 基因水平检测vsRNA1755激活细胞自噬 | 第79页 |
| 3. 蛋白水平验证vsRNA1755激活细胞自噬 | 第79-81页 |
| (三) vsRNA1755在轮状病毒感染过程中的调控机制 | 第81-86页 |
| 1. 轮状病毒感染宿主细胞后检测IGF1R表达水平(RT-PCR、Wb) | 第81-82页 |
| 2. 轮状病毒感染宿主细胞后检测pAkt、pmTOR水平 | 第82-83页 |
| 3. PI3K/Akt信号通路对病毒复制影响 | 第83-84页 |
| 4. vsRNA1755调控P13K/Akt/mTOR信号通路对病毒复制影响 | 第84-86页 |
| 四、讨论 | 第86-88页 |
| 五、小结 | 第88-89页 |
| 总结 | 第89-91页 |
| 展望 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-99页 |
| 附录 | 第99-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 个人简历 | 第110-111页 |
