| 致谢 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9页 |
| 缩略词表 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-24页 |
| 1.1 革兰氏阴性菌胞外多糖简介 | 第16-17页 |
| 1.2 大肠杆菌Nissle 1917 | 第17-18页 |
| 1.3 大肠杆菌荚膜多糖合成途径研究 | 第18-20页 |
| 1.3.1 Wzy依赖性途径的荚膜多糖合成 | 第18-19页 |
| 1.3.2 ABC转运蛋白依赖途径的荚膜多糖合成 | 第19-20页 |
| 1.4 E.coli K5荚膜多糖合成基因 | 第20-21页 |
| 1.5 EcN荚膜多糖的合成和调控 | 第21-22页 |
| 1.6 EcN荚膜多糖的应用 | 第22页 |
| 1.7 研究的内容、目的和意义 | 第22-24页 |
| 1.7.1 研究的内容 | 第22-23页 |
| 1.7.2 研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 第二章 EcN荚膜多糖的提取及鉴定 | 第24-29页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-25页 |
| 2.1.1 实验试剂 | 第24页 |
| 2.1.2 主要试剂及培养基的配制 | 第24-25页 |
| 2.1.3 仪器及材料 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-27页 |
| 2.2.1 EcN荚膜多糖的粗提取 | 第25-26页 |
| 2.2.2 EcN荚膜多糖的纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.3 核磁共振检测荚膜多糖 | 第27页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第27-28页 |
| 2.3.1 核磁共振检测EcN荚膜多糖 | 第27-28页 |
| 2.4 讨论 | 第28-29页 |
| 第三章 EcN中kfiA基因的基因敲除及荚膜多糖的鉴定 | 第29-44页 |
| 3.1 实验材料 | 第29-31页 |
| 3.1.1 实验试剂 | 第29页 |
| 3.1.2 主要试剂及培养基的配制 | 第29-30页 |
| 3.1.3 仪器及材料 | 第30-31页 |
| 3.2 实验方法 | 第31-36页 |
| 3.2.1 化学感受态的制备及化学转化 | 第31-32页 |
| 3.2.1.1 化学感受态的制备 | 第31页 |
| 3.2.1.2 化学转化 | 第31-32页 |
| 3.2.2 电击感受态的制备及电击转化 | 第32页 |
| 3.2.2.1 电击感受态的制备 | 第32页 |
| 3.2.2.2 电击转化 | 第32页 |
| 3.2.3 PCR扩增DNA片段 | 第32-33页 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第33-34页 |
| 3.2.5 大肠杆菌的基因敲除 | 第34-35页 |
| 3.2.6 突变株抗性基因的去除 | 第35页 |
| 3.2.7 生长曲线的测定 | 第35页 |
| 3.2.8 核磁共振检测荚膜多糖 | 第35-36页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第36-43页 |
| 3.3.1 EcN中的kfiA基因 | 第36-37页 |
| 3.3.2 基因敲除用到的引物、菌株及质粒 | 第37页 |
| 3.3.3 EcN菌株中kfiA基因的敲除 | 第37-38页 |
| 3.3.4 EcNΔkfiA::kan抗性基因的去除 | 第38-40页 |
| 3.3.5 kfiA突变株生长曲线的测定 | 第40-41页 |
| 3.3.6 ~1H NMR检测荚膜多糖 | 第41-43页 |
| 3.3.6.1 EcN荚膜多糖的检测 | 第41-42页 |
| 3.3.6.2 EcNΔkfiA荚膜多糖的检测 | 第42页 |
| 3.3.6.3 荚膜多糖含量的对比分析 | 第42-43页 |
| 3.4 讨论 | 第43-44页 |
| 第四章 EcNΔkfi A的基因回补及荚膜多糖的鉴定 | 第44-61页 |
| 4.1 实验材料 | 第44-46页 |
| 4.1.1 实验试剂 | 第44-45页 |
| 4.1.2 主要试剂及培养基的配制 | 第45页 |
| 4.1.3 仪器及材料 | 第45-46页 |
| 4.2 实验方法 | 第46-50页 |
| 4.2.1 大肠杆菌质粒的提取 | 第46-47页 |
| 4.2.2 目的片段及载体质粒的酶切 | 第47-48页 |
| 4.2.3 酶切产物纯化 | 第48页 |
| 4.2.4 DNA片段的连接 | 第48页 |
| 4.2.5 DNA片段胶回收 | 第48-49页 |
| 4.2.6 目的片段和载体质粒的连接化学转化 | 第49页 |
| 4.2.7 大肠杆菌的kfiA基因回补 | 第49页 |
| 4.2.8 kfiA回补株生长曲线的测定 | 第49-50页 |
| 4.2.9 核磁共振检测荚膜多糖 | 第50页 |
| 4.3 实验结果 | 第50-59页 |
| 4.3.1 kfiA基因回补所用到的引物、菌株及质粒 | 第50-51页 |
| 4.3.2 重组质粒pAH162-KpsMP-kfiA的构建 | 第51-55页 |
| 4.3.2.1 pAH123、pAH162质粒提取 | 第52-53页 |
| 4.3.2.2 PCR反应扩增KpsMP和kfiA | 第53页 |
| 4.3.2.3 PCR扩增KpsMP-kfiA片段 | 第53-54页 |
| 4.3.2.4 菌落PCR检测阳性菌 | 第54页 |
| 4.3.2.5 酶切检验重组质粒pAH162-KpsMP-kfiA | 第54-55页 |
| 4.3.3 菌落PCR检测kfiA回补菌株 | 第55-56页 |
| 4.3.4 kfiA回补株生长曲线的测定 | 第56-57页 |
| 4.3.5 ~1H NMR检测荚膜多糖 | 第57-59页 |
| 4.3.5.1 EcN荚膜多糖的检测 | 第57页 |
| 4.3.5.2 EcNΔkfiA荚膜多糖的检测 | 第57-58页 |
| 4.3.5.3 EcNΔkfiA IntΦ80::pAH162-KpsMP-kfiA荚膜多糖的检测 | 第58页 |
| 4.3.5.4 EcNΔkfiA IntΦ80::pAH162荚膜多糖的检测 | 第58-59页 |
| 4.3.5.5 荚膜多糖含量对比分析 | 第59页 |
| 4.4 讨论 | 第59-61页 |
| 第五章 结论与展望 | 第61-63页 |
| 5.1 结论 | 第61页 |
| 5.2 展望 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-69页 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 | 第69-70页 |
