| 中文摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-19页 |
| 参考文献 | 第17-19页 |
| 第一部分 胰腺癌细胞5-FU耐药相关蛋白筛查 | 第19-53页 |
| 一、亲本株及耐药株鉴定 | 第21-30页 |
| 1. 实验材料 | 第21-22页 |
| ·人胰腺癌细胞系 | 第21页 |
| ·人胰腺癌细胞系所需完全培养基及化疗药物的配置 | 第21页 |
| ·细胞培养所需的试剂及耗材 | 第21-22页 |
| 2. 实验方法 | 第22-26页 |
| ·细胞复苏及培养条件 | 第22-23页 |
| ·细胞传代 | 第23页 |
| ·细胞冻存 | 第23页 |
| ·细胞计数 | 第23-24页 |
| ·化疗耐药敏感性检测(CCK-8法) | 第24-25页 |
| ·细胞凋亡分析(Annexin V/PI双染法) | 第25-26页 |
| ·统计学方法 | 第26页 |
| 3. 实验结果 | 第26-30页 |
| ·亲本株及耐药株形态学差异 | 第26-27页 |
| ·亲本株及耐药株5-Fu耐药性差异 | 第27-28页 |
| ·亲本株及耐药株凋亡分析差异 | 第28-30页 |
| 二、耐药相关蛋白基因芯片及蛋白质组学筛查 | 第30-45页 |
| 1. 实验材料 | 第30-32页 |
| ·人胰腺癌细胞系 | 第30页 |
| ·人胰腺癌细胞系所需完全培养基及化疗药物的配置 | 第30-31页 |
| ·基因芯片筛查所需的试剂及仪器 | 第31-32页 |
| ·蛋白质组学筛查所需的试剂及仪器 | 第32页 |
| 2. 实验方法 | 第32-41页 |
| ·基因芯片筛查 | 第32-40页 |
| ·总RNA提取和质检 | 第32-34页 |
| ·RNA反转录和体外转录 | 第34-37页 |
| ·样品标记和杂交 | 第37-40页 |
| ·蛋白质组学筛查 | 第40-41页 |
| ·蛋白样品提取 | 第40页 |
| ·蛋白样品制备 | 第40页 |
| ·iTRAQ标记 | 第40页 |
| ·离线反相液相色谱(Offline RPLC) | 第40-41页 |
| ·LC-MS/MS液相色谱串联质谱分析 | 第41页 |
| ·蛋白质鉴定和定量 | 第41页 |
| ·IPA网络分析 | 第41页 |
| ·生物信息学分析软件 | 第41页 |
| 3. 实验结果 | 第41-45页 |
| 讨论 | 第45-48页 |
| 本部分研究小结 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-53页 |
| 第二部分 胰腺癌候选免疫原性膜抗原SLP-2和Prohibitin分子生物学功能研究 | 第53-97页 |
| 一、SLP-2在胰腺癌细胞中生物学功能研究 | 第54-83页 |
| 1. 实验材料 | 第54-60页 |
| ·人胰腺癌细胞系及相应培养基 | 第54页 |
| ·RNA抽提试剂及耗材 | 第54-55页 |
| ·RNA抽提相关试剂的配置 | 第55页 |
| ·逆转录RT-PCR及qRT-PCR主要试剂及仪器 | 第55-56页 |
| ·蛋白提取及检测试剂 | 第56页 |
| ·Western blotting主要试剂及配置方法 | 第56-58页 |
| ·siRNA相关试剂 | 第58-59页 |
| ·过表达质粒构建 | 第59-60页 |
| ·人SLP-2基因cDNA序列 | 第59页 |
| ·pIRES2-EGFP质粒信息 | 第59-60页 |
| ·质粒扩增LB液体培养基的制备 | 第60页 |
| 2. 实验方法 | 第60-71页 |
| ·Trizol法提取细胞总RNA | 第60-61页 |
| ·RNA纯度与浓度检测 | 第61页 |
| ·逆转录RT-PCR反应体系及条件 | 第61-62页 |
| ·Real-time PCR反应体系及条件 | 第62页 |
| ·细胞总蛋白提取 | 第62-63页 |
| ·BCA法测定总蛋白浓度 | 第63页 |
| ·蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blotting) | 第63-66页 |
| ·配置分离胶和浓缩胶 | 第63-64页 |
| ·电泳上样样品制备 | 第64页 |
| ·蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第64-65页 |
| ·蛋白质印迹(Western Blotting) | 第65页 |
| ·抗原抗体反应 | 第65页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光增强剂(ECL)显色反应 | 第65-66页 |
| ·过表达质粒构建 | 第66-67页 |
| ·质粒小提方法 | 第67-68页 |
| ·细胞转染 | 第68-69页 |
| ·细胞增殖检测(CCK-8法) | 第69页 |
| ·细胞体外迁移和侵袭实验 | 第69-70页 |
| ·统计学方法 | 第70-71页 |
| 3. 实验结果 | 第71-82页 |
| ·Slp-2蛋白在人胰腺癌细胞系中的表达情况 | 第71-75页 |
| ·人胰腺癌细胞系中slp-2 mRNA的表达情况 | 第71-73页 |
| ·BCA法测定蛋白浓度的标准曲线 | 第73页 |
| ·人胰腺癌细胞系中Slp-2蛋白的表达情况 | 第73-75页 |
| ·荧光显微镜下胰腺癌细胞系MIAPaCa-2及BxPC-3转染效率的测定 | 第75-76页 |
| ·Slp-2过表达质粒瞬时干扰胰腺癌细胞内SLP-2蛋白表达水平有效性的测定 | 第76-77页 |
| ·Slp-2抑制序列瞬时干扰胰腺癌细胞内SLP-2蛋白表达水平有效性的测定 | 第77-78页 |
| ·Slp-2蛋白对胰腺癌细胞增殖能力的影响 | 第78-80页 |
| ·Slp-2蛋白对胰腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响 | 第80-82页 |
| 4. 讨论 | 第82-83页 |
| 二、Prohibitin过表达对胰腺癌细胞中生物学功能的影响 | 第83-92页 |
| 1. 实验材料 | 第83-84页 |
| ·人胰腺癌细胞系及相应培养基 | 第83页 |
| ·qPCR引物设计 | 第83页 |
| ·Western blotting所用抗体 | 第83-84页 |
| ·过表达质粒构建 | 第84页 |
| ·人Prohibitin基因cDNA序列 | 第84页 |
| ·pIRES2-EGFP质粒信息 | 第84页 |
| 2. 实验方法 | 第84-85页 |
| 3. 实验结果 | 第85-91页 |
| ·Prohibitin蛋白在人胰腺癌细胞系中的表达情况 | 第85-88页 |
| ·人胰腺癌细胞系中prohibitin mRNA的表达情况 | 第85-86页 |
| ·人胰腺癌细胞系中Prohibitin蛋白的表达情况 | 第86-88页 |
| ·Prohibitin过表达质粒瞬时干扰胰腺癌细胞内Prohibitin蛋白表达水平有效性测定 | 第88-89页 |
| ·Prohibitin蛋白对胰腺癌细胞增殖能力的影响 | 第89页 |
| ·Prohibitin蛋白对胰腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响 | 第89-91页 |
| 4. 讨论 | 第91-92页 |
| 本部分研究小结 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
