| 缩略语表 | 第1-13页 |
| 第一部分 FAT10在H5N1病毒复制中的作用 | 第13-90页 |
| 中文摘要 | 第14-15页 |
| Abstract | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-19页 |
| 第一节 禽流感H5N1病毒的接种、培养和浓缩 | 第19-21页 |
| 1 实验材料 | 第19页 |
| ·仪器和器材 | 第19页 |
| ·试剂 | 第19页 |
| ·病毒来源 | 第19页 |
| ·动物材料 | 第19页 |
| 2 实验方法 | 第19-21页 |
| ·活胚检查 | 第19-20页 |
| ·鸡胚尿囊腔接种 | 第20页 |
| ·H5N1流感病毒的收获 | 第20页 |
| ·鸡胚尿囊液中病毒的初步分离 | 第20页 |
| ·超速离心法浓缩流感病毒 | 第20-21页 |
| 第二节 H5N1禽流感病毒的血凝单位及50%培养组织感染剂量(TCID50)测定 | 第21-24页 |
| 1 实验材料 | 第21页 |
| ·仪器 | 第21页 |
| ·试剂 | 第21页 |
| ·病毒 | 第21页 |
| ·细胞 | 第21页 |
| 2 实验方法 | 第21-24页 |
| ·制备1%鸡红细胞悬液 | 第21页 |
| ·MDCK细胞的培养 | 第21-22页 |
| ·H5N1禽流感病毒的血凝单位测定 | 第22页 |
| ·H5N1禽流感病毒50%培养组织感染剂量(TCID50)的测定 | 第22-24页 |
| 第三节 H5N1禽流感病毒感染小鼠肺组织的基因表达谱分析 | 第24-32页 |
| 1 实验材料 | 第24页 |
| ·实验环境 | 第24页 |
| ·仪器 | 第24页 |
| ·试剂 | 第24页 |
| ·病毒 | 第24页 |
| ·动物 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-25页 |
| ·伦理声明 | 第24-25页 |
| ·气管注射H5N1禽流感病毒致小鼠感染 | 第25页 |
| ·H5N1禽流感病毒感染小鼠肺组织的取样及保存 | 第25页 |
| ·H5N1禽流感病毒感染小鼠肺组织的基因表达谱分析 | 第25页 |
| 3 实验结果 | 第25-32页 |
| ·RNA样品质控信息 | 第25-26页 |
| ·Gene Ontology分析 | 第26-28页 |
| ·生物学过程分析(Biological Process) | 第26-27页 |
| ·细胞组分分析(Cellular Component) | 第27页 |
| ·分子功能分析(Molecular Function) | 第27-28页 |
| ·Pathway分析 | 第28-30页 |
| ·Fold Change分析 | 第30-32页 |
| 第四节 H5N1禽流感病毒能够诱导类泛素蛋白FAT10的表达上调 | 第32-43页 |
| 1 实验材料 | 第32-33页 |
| ·实验环境 | 第32页 |
| ·实验仪器 | 第32页 |
| ·实验试剂 | 第32-33页 |
| ·细胞株 | 第32页 |
| ·病毒株 | 第32页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第32-33页 |
| ·化学试剂 | 第33页 |
| ·抗体 | 第33页 |
| ·实验动物 | 第33页 |
| 2 实验方法 | 第33-38页 |
| ·Western blotting检测目的蛋白表达量 | 第33-35页 |
| ·western blotting样品准备 | 第33页 |
| ·主要溶液配制 | 第33-34页 |
| ·Western blotting检测FAT10表达量 | 第34-35页 |
| ·荧光定量PCR检测FAT10的相对表达量 | 第35-38页 |
| ·样品准备 | 第35-36页 |
| ·总RNA提取 | 第36页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第36-37页 |
| ·荧光定量PCR检测 | 第37-38页 |
| 3 实验结果 | 第38-43页 |
| ·H5N1禽流感病毒感染的小鼠肺组织中FAT10表达上调 | 第38-39页 |
| ·H5N1禽流感病毒能够诱导FAT10在呼吸道上皮细胞系中的表达上调 | 第39-43页 |
| 第五节 FAT10在H5N1禽流感病毒复制过程中起重要作用 | 第43-59页 |
| 1 实验材料 | 第43-47页 |
| ·实验环境 | 第43页 |
| ·实验仪器 | 第43页 |
| ·实验试剂 | 第43-47页 |
| ·细胞株 | 第43页 |
| ·病毒株 | 第43页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第43-44页 |
| ·质粒 | 第44-45页 |
| ·细菌 | 第45页 |
| ·siRNA | 第45-46页 |
| ·荧光定量PCR引物 | 第46页 |
| ·化学试剂 | 第46-47页 |
| ·抗体 | 第47页 |
| 2 实验方法 | 第47-51页 |
| ·质粒构建和提取 | 第47-50页 |
| ·重要溶液配制 | 第47-48页 |
| ·pWPXL-FAT10的构建 | 第48页 |
| ·pSIREN-RetroQ-FAT10的构建 | 第48-49页 |
| ·质粒的大量提取 | 第49-50页 |
| ·细胞培养和慢病毒包装 | 第50-51页 |
| ·贴壁细胞培养 | 第50页 |
| ·细胞冻存 | 第50页 |
| ·细胞复苏 | 第50页 |
| ·慢病毒包装 | 第50-51页 |
| 3 实验结果 | 第51-59页 |
| ·敲减FAT10能够抑制24h p.o.i呼吸道上皮细胞系中病毒M1基因mRNA表达水平 | 第51-53页 |
| ·敲减FAT10能够抑制24h p.o.i呼吸道上皮细胞系中病毒NP蛋白的表达水平 | 第53-55页 |
| ·敲减FAT10能够抑制12h p.o.i呼吸道上皮细胞系中病毒M1基因mRNA表达水平 | 第55页 |
| ·超表达FAT10能够引起12h p.o.i呼吸道上皮细胞系中病毒M1基因mRNA表达水平升高 | 第55-56页 |
| ·敲减UBA6或USE1能够抑制12h p.o.i呼吸道上皮细胞系中病毒M1基因mRNA表达水平 | 第56-57页 |
| ·敲减及超表达FAT10能影响A549细胞感染HSN1病毒后细胞上清中的病毒滴度 | 第57-59页 |
| 第六节 H5N1禽流感病毒诱导FAT10表达上调的信号通路研究 | 第59-71页 |
| 1 实验材料 | 第59-61页 |
| ·实验仪器 | 第59页 |
| ·实验试剂 | 第59-61页 |
| ·细胞株 | 第59页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第59页 |
| ·试剂盒 | 第59页 |
| ·主要化学试剂 | 第59-60页 |
| ·质粒 | 第60页 |
| ·细菌 | 第60-61页 |
| 2 实验方法 | 第61-64页 |
| ·pEAK13-FLAG-PB1-F2质粒构建 | 第61页 |
| ·siRNA转染 | 第61页 |
| ·双萤光素酶报告实验 | 第61-63页 |
| ·质粒构建 | 第61-62页 |
| ·双萤光素酶活性测定 | 第62-63页 |
| ·P65结合位点突变实验 | 第63-64页 |
| ·突变位点 | 第63页 |
| ·引物设计 | 第63页 |
| ·点突变质粒构建 | 第63-64页 |
| 3 实验结果 | 第64-71页 |
| ·293T细胞中转染H5N1病毒蛋白表达质粒不会引起FAT10 mRNA表达显著升高 | 第64页 |
| ·双链RNA类似物poly(IC)能够显著上调FAT10 mRNA表达水平 | 第64-66页 |
| ·H5N1病毒NS1蛋白能够抑制FAT10 mRNA的表达水平 | 第66页 |
| ·双链RNA类似物poly(IC)能够激活FAT10启动子 | 第66-67页 |
| ·RIG-I是poly(IC)诱导FAT10表达的主要感受器分子 | 第67-68页 |
| ·p65是介导poly(Ic)诱导FAT10表达的主要转录因子 | 第68-69页 |
| ·突变FAT10启动子内的p65结合位点能显著抑制poly(IC)对FAT10的诱导表达 | 第69-70页 |
| ·HSN1病毒vRNA和cRNA诱导FAT10表达上调的通路分析 | 第70-71页 |
| 第七节 在HSN1病毒感染过程中p62受FAT10修饰并起抗病毒作用 | 第71-78页 |
| 1 实验材料 | 第71-72页 |
| ·实验环境 | 第71页 |
| ·实验仪器 | 第71页 |
| ·实验试剂 | 第71-72页 |
| ·细胞株 | 第71页 |
| ·病毒株 | 第71页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第71-72页 |
| ·化学试剂 | 第72页 |
| ·抗体 | 第72页 |
| 2 实验方法 | 第72-73页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第72-73页 |
| ·免疫共沉淀检测H5N1病毒感染A549细胞后FAT10对p62的修饰 | 第73页 |
| 3 实验结果 | 第73-78页 |
| ·在H5N1病毒感染过程中p62受FAT10修饰 | 第73-74页 |
| ·H5N1禽流感病毒感染A549细胞后诱导p62表达上调 | 第74-75页 |
| ·敲减FAT10能够显著上调p62蛋白表达水平 | 第75-76页 |
| ·敲减p62引起H5N1病毒M1和NP基因表达水平升高 | 第76-78页 |
| 第八节 H5N1病毒感染过程中p62能够调控JAK-STAT1信号通路 | 第78-83页 |
| 1 实验材料 | 第78-79页 |
| ·实验环境 | 第78页 |
| ·实验仪器 | 第78页 |
| ·实验试剂 | 第78-79页 |
| ·细胞株 | 第78页 |
| ·病毒株 | 第78页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第78-79页 |
| ·化学试剂 | 第79页 |
| ·抗体 | 第79页 |
| 2 实验方法 | 第79-80页 |
| ·western blotting检测STAT1磷酸化水平 | 第79-80页 |
| ·在A549细胞中敲减p62及FAT10 | 第79页 |
| ·H5N1病毒感染A549细胞实验 | 第79-80页 |
| 3 实验结果 | 第80-83页 |
| ·H5N1禽流感病毒感染A549细胞引起STAT1磷酸化水平升高 | 第80页 |
| ·A549细胞中敲减STAT1引起H5N1病毒M1基因mRNA水平和病毒滴度显著升高 | 第80-81页 |
| ·A549细胞中敲减p62能够引起STAT1磷酸化水平降低 | 第81-82页 |
| ·A549细胞中敲减FAT10能够引起STAT1磷酸化水平上升 | 第82-83页 |
| 结论 | 第83-84页 |
| 讨论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-90页 |
| 第二部分 FAT10在H5N1病毒诱导的细胞死亡中的作用 | 第90-117页 |
| 中文摘要 | 第91-92页 |
| Abstract | 第92-93页 |
| 前言 | 第93-95页 |
| 第一节 敲减FAT10能够缓解H5N1病毒引起的细胞死亡 | 第95-99页 |
| 1 实验材料 | 第95-96页 |
| ·实验环境 | 第95页 |
| ·实验仪器 | 第95页 |
| ·实验试剂 | 第95-96页 |
| ·细胞株 | 第95页 |
| ·病毒株 | 第95页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第95页 |
| ·化学试剂 | 第95-96页 |
| ·siRNA | 第96页 |
| 2 实验方法 | 第96-97页 |
| ·H5N1病毒感染A549、BEAS-2B、CNE-2B细胞实验 | 第96页 |
| ·在A549、BEAS-2B、CNE-2B细胞中敲减FAT10 | 第96页 |
| ·MTS方法测定细胞活性 | 第96-97页 |
| 3 实验结果 | 第97-99页 |
| ·A549细胞中敲减FAT10能够缓解H5N1病毒感染引起的细胞死亡 | 第97页 |
| ·BEAS-2B和CNE-2Z细胞中敲减FAT10同样能够缓解HSN1病毒感染引起的细胞死亡 | 第97-99页 |
| 第二节 敲减FAT10能够抑制H5N1病毒诱导的细胞凋亡 | 第99-108页 |
| 1 实验材料 | 第99-100页 |
| ·实验环境 | 第99页 |
| ·实验仪器 | 第99页 |
| ·实验试剂 | 第99-100页 |
| ·细胞株 | 第99页 |
| ·病毒株 | 第99页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第99-100页 |
| ·化学试剂 | 第100页 |
| ·抗体 | 第100页 |
| 2 实验方法 | 第100-103页 |
| ·流式细胞术检测H5N1病毒诱导的细胞凋亡 | 第100页 |
| ·western blotting检测H5N1病毒感染细胞中Caspase剪切水平 | 第100-101页 |
| ·荧光定量PCR检测TNFα和FASLG的mRNA表达水平 | 第101-103页 |
| 3 实验结果 | 第103-108页 |
| ·BEAS-2B细胞中敲减FAT10能够抑制H5N1病毒感染引起的Caspase-3剪切 | 第103-104页 |
| ·流式细胞术检测敲减FAT10对H5N1病毒引起细胞凋亡的影响 | 第104-105页 |
| ·A549细胞或BEAS-2B细胞中敲减FAT10能够抑制TNFα和FASLG mRNA水平 | 第105-108页 |
| 第三节 敲减FAT10不能抑制H5N1病毒诱导的细胞自噬 | 第108-111页 |
| 1 实验材料 | 第108-109页 |
| ·实验环境 | 第108页 |
| ·实验仪器 | 第108页 |
| ·实验试剂 | 第108-109页 |
| ·细胞株 | 第108页 |
| ·病毒株 | 第108页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第108页 |
| ·化学试剂 | 第108-109页 |
| ·抗体 | 第109页 |
| 2 实验方法 | 第109页 |
| ·western blotting检测H5N1病毒感染后细胞中LC3B蛋白水平 | 第109页 |
| 3 实验结果 | 第109-111页 |
| ·A549细胞中敲减FAT10不能抑制H5N1病毒诱导的LC3B蛋白水平 | 第109-111页 |
| 结论 | 第111-112页 |
| 讨论 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-117页 |
| 第三部分 FAT10在甲型H1N1流感病毒感染呼吸道上皮细胞中的作用 | 第117-129页 |
| 中文摘要 | 第118-119页 |
| Abstract | 第119-120页 |
| 前言 | 第120-121页 |
| 1 实验材料 | 第121-122页 |
| ·实验环境 | 第121页 |
| ·实验仪器 | 第121页 |
| ·实验试剂 | 第121-122页 |
| ·细胞株 | 第121页 |
| ·病毒株 | 第121页 |
| ·细胞培养及转染试剂 | 第121页 |
| ·化学试剂 | 第121-122页 |
| ·抗体 | 第122页 |
| 2 实验方法 | 第122-123页 |
| ·流式细胞术检测A/Wenshan H1N1病毒诱导的细胞凋亡 | 第122页 |
| ·western blotting检测A/Wenshan H1N1病毒感染细胞中Caspase-3剪切水平 | 第122页 |
| ·荧光定量PCR检测TNFα和M1的mRNA表达水平 | 第122-123页 |
| 3 实验结果 | 第123-126页 |
| ·A/Wenshan H1N1感染CNE-2Z细胞能够引起FAT10表达上调 | 第123页 |
| ·流式细胞术检测敲减FAT10后A/Wenshan H1N1病毒感染细胞的凋亡水平 | 第123-124页 |
| ·CNE-2Z细胞中敲减FAT10能够抑制A/Wenshan H1N1病毒引起的caspase-3剪切 | 第124-125页 |
| ·CNE-2Z细胞中敲减FAT10能够抑制TNFα mRNA水平 | 第125页 |
| ·CNE-2Z细胞中敲减FAT10能够抑制病毒M1 mRNA水平 | 第125-126页 |
| 结论 | 第126-127页 |
| 讨论 | 第127页 |
| 参考文献 | 第127-129页 |
| 综述：H5N1流感病毒与细胞因子风暴 | 第129-148页 |
| 参考文献 | 第136-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
| 个人简历 | 第149-151页 |
