| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-30页 |
| ·3-羟基丙酸概况 | 第18-24页 |
| ·3-羟基丙酸理化特性及应用 | 第18页 |
| ·化学法生产3-羟基丙酸 | 第18-19页 |
| ·生物法生产3-羟基丙酸 | 第19-24页 |
| ·甘油歧化生产3-HP耦合辅酶平衡 | 第24页 |
| ·同源重组技术 | 第24-27页 |
| ·RecA同源重组 | 第24-25页 |
| ·λ-Red 重组系统 | 第25-26页 |
| ·MAGE技术 | 第26-27页 |
| ·连续易错PCR | 第27-28页 |
| ·本课题研究意义内容 | 第28-30页 |
| 第二章 肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因的克隆与表达 | 第30-48页 |
| ·引言 | 第30页 |
| ·实验材料 | 第30-31页 |
| ·菌株与质粒 | 第30页 |
| ·试剂与仪器 | 第30页 |
| ·溶液配制与培养基 | 第30-31页 |
| ·实验方法 | 第31-37页 |
| ·培养方法 | 第31-32页 |
| ·K. pneumoniae基因组DNA的提取 | 第32页 |
| ·PCR扩增K. pneumoniae甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC | 第32-33页 |
| ·重组质粒pET-pk-dhaB的构建 | 第33页 |
| ·重组质粒pET-pk-dhaB的转化与阳性克隆的筛选鉴定 | 第33-35页 |
| ·重组质粒pET-pk-dhaB-puuC的构建 | 第35页 |
| ·重组质粒pET-pk-dhaB-puuC的转化与阳性克隆的筛选鉴定 | 第35-36页 |
| ·dhaB基因和puuC基因在工程菌种的表达 | 第36页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)培养基优化 | 第36-37页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)摇瓶发酵培养 | 第37页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)上罐发酵 | 第37页 |
| ·分析方法 | 第37页 |
| ·结果与讨论 | 第37-46页 |
| ·K. pneumoniae基因组DNA的提取 | 第37-38页 |
| ·PCR扩增K. pneumoniae甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC | 第38-39页 |
| ·阳性克隆E. coli(pET-pk-dhaB)的筛选与鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pET-pk-dhaB-puuC的构建 | 第40-41页 |
| ·工程菌K. p(pET-pk-dhaB-puuC)的筛选与鉴定 | 第41-42页 |
| ·pET-pk-dhaB-puuC在K. pneumoniae中的表达 | 第42-43页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)培养基优化 | 第43页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)摇瓶发酵 | 第43-45页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)上罐发酵生产3-HP | 第45-46页 |
| ·本章小结 | 第46-48页 |
| 第三章 肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸生产耦合NAD+再生 | 第48-58页 |
| ·引言 | 第48页 |
| ·实验材料 | 第48-49页 |
| ·菌株及质粒 | 第48页 |
| ·试剂与仪器 | 第48-49页 |
| ·培养基 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-50页 |
| ·聚合酶链式反应扩增酿酒酵母GPD1基因 | 第49页 |
| ·重组质粒pET-pk-dhaB-puuC-GPD1的构建 | 第49-50页 |
| ·重组质粒的转化与阳性克隆K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)的筛选鉴定 | 第50页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)摇瓶发酵培养生产3-HP | 第50页 |
| ·分析方法 | 第50-51页 |
| ·结果与讨论 | 第51-56页 |
| ·聚合酶链式反应扩增酿酒酵母GPD1基因 | 第51页 |
| ·重组质粒pET-pk-dhaB-puuC-GPD1的构建 | 第51-52页 |
| ·阳性克隆K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)的筛选鉴定 | 第52-53页 |
| ·工程菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)摇瓶发酵培养 | 第53-56页 |
| ·本章小结 | 第56-58页 |
| 第四章 λ-Red同源重组技术的建立 | 第58-64页 |
| ·引言 | 第58页 |
| ·实验材料 | 第58页 |
| ·菌株及质粒 | 第58页 |
| ·试剂与仪器 | 第58页 |
| ·试剂与培养基 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-60页 |
| ·聚合酶链式反应扩增λ-Red重组酶基因及其启动子 | 第58-59页 |
| ·重组质粒pET-ParaB-Red的构建 | 第59页 |
| ·阳性克隆K.p(pET-ParaB-Red)的筛选与鉴定 | 第59-60页 |
| ·L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达 | 第60页 |
| ·结果与讨论 | 第60-63页 |
| ·λ-Red重组酶基因的扩增 | 第60-61页 |
| ·pET-ParaB-Red质粒的构建 | 第61页 |
| ·阳性克隆K.p(pET-ParaB-Red)的筛选与鉴定 | 第61-62页 |
| ·重组酶在L-阿拉伯糖诱导下表达重组酶 | 第62-63页 |
| ·本章小结 | 第63-64页 |
| 第五章 λ-Red重组构建3-羟基丙酸生产平台工程菌 | 第64-74页 |
| ·引言 | 第64页 |
| ·实验材料 | 第64页 |
| ·菌株及质粒 | 第64页 |
| ·试剂与仪器 | 第64页 |
| ·培养基 | 第64页 |
| ·实验方法 | 第64-67页 |
| ·连续易错PCR扩增重组片段 | 第64-65页 |
| ·连续λ-Red重组技术转化宿主菌K. pneumoniae(pET-ParaB-Red) | 第65-66页 |
| ·重组菌的高通量筛选 | 第66页 |
| ·优良菌株摇瓶发酵生产3-HP | 第66-67页 |
| ·优良菌株重组酶氨基酸序列分析 | 第67页 |
| ·遗传稳定性研究 | 第67页 |
| ·结果与讨论 | 第67-72页 |
| ·连续易错PCR扩增重组片段 | 第67页 |
| ·重组菌的高通量筛选 | 第67-69页 |
| ·优良菌株摇瓶发酵生产3-HP | 第69-71页 |
| ·菌株重组蛋白氨基酸序列分析 | 第71-72页 |
| ·遗传稳定性 | 第72页 |
| ·本章小结 | 第72-74页 |
| 第六章 总结与建议 | 第74-76页 |
| ·结论 | 第74-75页 |
| ·创新点 | 第75页 |
| ·问题与建议 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-80页 |
| 附录1 试剂 | 第80-82页 |
| 附录2 仪器 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第84-85页 |
| 作者和导师简介 | 第85-86页 |
| 硕士研宄生学位论文答辩委员会决议书 | 第86-87页 |
