| 论文创新点 | 第1-8页 |
| 目录 | 第8-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-18页 |
| 研究意义 | 第18-19页 |
| 技术路线 | 第19-20页 |
| 第一部分 文献综述 | 第20-48页 |
| 第一章 流感病毒生物学特性 | 第20-39页 |
| ·流感病毒的成分构成与基因组 | 第20-22页 |
| ·流感病毒的蛋白结构与功能 | 第22-27页 |
| ·聚合酶蛋白PB2 | 第22页 |
| ·聚合酶蛋白PB1 | 第22-23页 |
| ·聚合酶蛋白PA | 第23页 |
| ·血凝素蛋白HA | 第23-24页 |
| ·核蛋白NP | 第24页 |
| ·神经氨酸酶蛋白NA | 第24-25页 |
| ·基质蛋白M1 | 第25页 |
| ·离子通道蛋白M2 | 第25-26页 |
| ·非结构蛋白NS1 | 第26页 |
| ·核输出蛋白NEP | 第26-27页 |
| ·新鉴定蛋白PB1-F2与N40 | 第27页 |
| ·流感病毒的复制周期 | 第27-30页 |
| ·流感病毒与宿主细胞的结合与融合 | 第27-28页 |
| ·病毒RNA的转录与复制 | 第28-29页 |
| ·病毒蛋白的翻译和表达 | 第29页 |
| ·病毒组分的装配与出芽 | 第29-30页 |
| ·流感病毒跨种间传播的分子机制 | 第30-34页 |
| ·病毒蛋白特定氨基酸突变对其与受体结合特异性的影响 | 第30-31页 |
| ·流感病毒血凝素HA和神经氨酸酶NA的功能平衡影响病毒结合特异性 | 第31-32页 |
| ·流感病毒跨种间传播途径与机理 | 第32-34页 |
| ·流感病毒诱导宿主通路及干扰素诱导效应因子 | 第34-39页 |
| ·NF-κB-IFN信号通路 | 第34-35页 |
| ·干扰素诱导效应因子 | 第35-39页 |
| 第二章 亚细胞蛋白质组学及其在病毒研究中的应用进展 | 第39-48页 |
| ·细胞核蛋白质组学 | 第39-40页 |
| ·核仁蛋白质组学 | 第40-42页 |
| ·线粒体蛋白质组学 | 第42-43页 |
| ·细胞骨架蛋白质组学 | 第43-44页 |
| ·膜蛋白质组学 | 第44-45页 |
| ·其它细胞器蛋白质组学 | 第45-48页 |
| ·高尔基体蛋白质组学 | 第45-46页 |
| ·内质网蛋白质组学 | 第46页 |
| ·过氧化物酶体和溶酶体蛋白质组学 | 第46-48页 |
| 第二部分 研究内容 | 第48-152页 |
| 第一章 流感病毒NP、M1、NS1蛋白表达及抗体制备 | 第48-76页 |
| 摘要 | 第48-49页 |
| 1 材料与方法 | 第49-61页 |
| ·实验材料 | 第49-50页 |
| ·毒株、菌株、细胞、鸡胚和动物 | 第49页 |
| ·载体、抗体、酶和试剂 | 第49-50页 |
| ·实验方法 | 第50-61页 |
| ·病毒扩繁 | 第50页 |
| ·病毒纯化 | 第50页 |
| ·病毒NP,M1,NS1基因的克隆 | 第50-52页 |
| ·引物设计 | 第50-51页 |
| ·病毒总RNA抽提 | 第51页 |
| ·反转录 | 第51-52页 |
| ·PCR目的基因全长扩增 | 第52页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第52页 |
| ·TA连接反应 | 第52-53页 |
| ·感受态细胞制备 | 第53页 |
| ·转化 | 第53-54页 |
| ·碱裂解法抽提重组质粒 | 第54页 |
| ·重组质粒PCR鉴定和测序 | 第54页 |
| ·SIVH3N2-NP,M1,NS1基因的原核表达和蛋白纯化 | 第54-56页 |
| ·NP、M1和NS1原核表达载体构建 | 第54-55页 |
| ·重组NP、M1和NS1蛋白的诱导表达 | 第55-56页 |
| ·重组NP、M1和NS1蛋白的纯化 | 第56页 |
| ·抗SIVH3N2 NP、M1和NS1蛋白单克隆抗体制备 | 第56-59页 |
| ·小鼠免疫 | 第56-57页 |
| ·细胞融合及选择性培养 | 第57页 |
| ·融合细胞的筛选、有限稀释及单克隆化 | 第57-58页 |
| ·单抗腹水制备、亚类(型)及效价测定 | 第58页 |
| ·单抗腹水特异性鉴定 | 第58-59页 |
| ·Western blot | 第58-59页 |
| ·间接免疫荧光(IFA) | 第59页 |
| ·SIV H3N2病毒NP、M1、NS1真核表达分析 | 第59-60页 |
| ·NP、M1、NS1真核表达载体构建 | 第59页 |
| ·真核表达质粒的超纯 | 第59-60页 |
| ·超纯质粒转染、目的基因真核表达的IFA检测 | 第60页 |
| ·兔抗SIV H3N2病毒NP、M1和NS1蛋白多克隆抗体制备 | 第60页 |
| ·双免疫荧光染色 | 第60-61页 |
| 2 结果 | 第61-74页 |
| ·SIV H3N2病毒基因NP、M1、NS1的RT-PCR | 第61页 |
| ·SIV H3N2 NP、M1、NS1基因原核表达载体的构建 | 第61-62页 |
| ·SIV H3N2 NP、M1、NS1蛋白在E.coli BL21(DE3)中诱导表达 | 第62-63页 |
| ·SIV H3N2 NP、M1、NS1原核重组表达蛋白的纯化 | 第63-65页 |
| ·SIV H3N2 NP、M1、NS1蛋白单克隆抗体制备 | 第65-67页 |
| ·SIV H3N2病毒蛋白单克隆抗体的反应特异性鉴定 | 第67-68页 |
| ·单克隆抗体亚类鉴定及腹水效价 | 第68-69页 |
| ·SIV H3N2 NP、M1、NS1真核表达载体构建及转染 | 第69-70页 |
| ·SIV H3N2 NP、M1、NS1蛋白兔多克隆抗体制备 | 第70页 |
| ·NP,M1,NS1蛋白在不同亚型流感病毒感染细胞内的定位关系 | 第70-74页 |
| ·NS1与NP的定位关系 | 第70-71页 |
| ·NP与M1的定位关系 | 第71-72页 |
| ·M1与NS1的定位关系 | 第72-74页 |
| 3 讨论 | 第74-76页 |
| 第二章 SIV感染A549的质、核亚细胞差异蛋白组分析 | 第76-124页 |
| 摘要 | 第76-77页 |
| 1 材料与方法 | 第77-86页 |
| ·实验材料 | 第77-78页 |
| ·毒株与细胞 | 第77页 |
| ·试剂与抗体 | 第77-78页 |
| ·仪器与软件 | 第78页 |
| ·实验方法 | 第78-86页 |
| ·样品制备 | 第78-79页 |
| ·亚细胞组分(胞质、胞核)的二维凝胶电泳 | 第79-81页 |
| ·一向等电聚焦 | 第79-80页 |
| ·胶条平衡 | 第80页 |
| ·二向SDS-PAGE分离 | 第80-81页 |
| ·银染 | 第81页 |
| ·图像扫描及软件分析 | 第81-82页 |
| ·挖点及胰蛋白酶解 | 第82页 |
| ·MALDI-TOF/TOF质谱鉴定及数据库检索 | 第82-83页 |
| ·差异蛋白的功能分类 | 第83页 |
| ·构建差异蛋白互作网络分析 | 第83-84页 |
| ·Western blot验证 | 第84页 |
| ·免疫荧光(IFA)验证 | 第84页 |
| ·免疫共沉淀分析 | 第84-85页 |
| ·WARS蛋白的siRNA干扰 | 第85页 |
| ·WARS蛋白的过表达 | 第85-86页 |
| ·绝对定量PCR检测病毒拷贝数 | 第86页 |
| ·差异表达蛋白IF135的移位鉴定 | 第86页 |
| 2 结果 | 第86-120页 |
| ·样品制备 | 第86-88页 |
| ·SIV H3N2感染A549的胞质、胞核二维电泳分析 | 第88-90页 |
| ·二维凝胶电泳 | 第88-89页 |
| ·二维电泳图谱分析 | 第89-90页 |
| ·差异表达蛋白的质谱鉴定 | 第90-102页 |
| ·差异表达蛋白的功能分类 | 第102-103页 |
| ·差异表达蛋白的IPA分析 | 第103-106页 |
| ·差异表达蛋白的Western blot验证 | 第106-107页 |
| ·差异表达蛋白的免疫荧光验证 | 第107-113页 |
| ·HA-NS1与Flag-hnRNP C2的免疫共沉淀分析 | 第113-114页 |
| ·差异表达蛋白WARS的siRNA干扰分析 | 第114-115页 |
| ·差异表达蛋白WARS的过表达分析 | 第115-116页 |
| ·差异表达蛋白WARS对病毒载量的影响分析 | 第116-117页 |
| ·差异表达蛋白IF135的移位鉴定 | 第117-120页 |
| 3 讨论 | 第120-124页 |
| ·病毒感染与RNA加工、凋亡相关蛋白 | 第120-122页 |
| ·病毒感染与NF-KB-IFN通路及干扰素诱导效应蛋白 | 第122-123页 |
| ·病毒感染与脂类代谢相关蛋白 | 第123-124页 |
| 第三章 SIV感染A549的线粒体差异蛋白组分析 | 第124-152页 |
| 摘要 | 第124-126页 |
| 1 材料与方法 | 第126-132页 |
| ·实验材料 | 第126-127页 |
| ·毒株与细胞 | 第126页 |
| ·试剂与抗体 | 第126页 |
| ·仪器与软件 | 第126-127页 |
| ·实验方法 | 第127-132页 |
| ·样品制备 | 第127页 |
| ·线粒体组分的电镜观察 | 第127页 |
| ·线粒体组分的二维凝胶电泳 | 第127-128页 |
| ·一向等电聚焦 | 第128页 |
| ·胶条平衡 | 第128页 |
| ·二向SDS-PAGE分离 | 第128页 |
| ·银染 | 第128页 |
| ·图像扫描及软件分析 | 第128页 |
| ·挖点及胰蛋白酶解 | 第128页 |
| ·MALDI-TOF/TOF质谱鉴定及数据库检索 | 第128页 |
| ·差异蛋白的功能分类 | 第128-129页 |
| ·实时RT-PCR | 第129-131页 |
| ·引物设计 | 第129-130页 |
| ·细胞总RNA抽提 | 第130页 |
| ·反转录RT | 第130页 |
| ·实时定量PCR | 第130-131页 |
| ·差异蛋白Network网络及pathway通路分析 | 第131页 |
| ·差异表达蛋白APOL2的移位鉴定 | 第131-132页 |
| 2 结果 | 第132-148页 |
| ·样品制备及线粒体组分纯度鉴定 | 第132-133页 |
| ·SIV H3N2感染A549的线粒体二维电泳分析 | 第133-134页 |
| ·二维凝胶电泳 | 第133页 |
| ·二维电泳图谱分析 | 第133-134页 |
| ·差异表达蛋白的质谱鉴定 | 第134-142页 |
| ·差异表达蛋白的功能分类 | 第142-143页 |
| ·差异表达蛋白的转录本分析 | 第143-144页 |
| ·差异表达蛋白的IPA分析 | 第144-147页 |
| ·差异表达蛋白APOL2的移位鉴定 | 第147-148页 |
| 3 讨论 | 第148-152页 |
| ·流感病毒感染引起细胞死亡相关蛋白表达变化 | 第148-149页 |
| ·蛋白组装与转运相关蛋白 | 第149页 |
| ·整合蛋白与细胞间信号传递 | 第149-150页 |
| ·RNA加工与翻译 | 第150-151页 |
| ·能量代谢 | 第151-152页 |
| 全文总结 | 第152-153页 |
| 参考文献 | 第153-170页 |
| 附录A 全文缩略语 | 第170-172页 |
| 附录B 常用缓冲液及配方 | 第172-179页 |
| 附录C 博士期间录用或待发表的学术论文 | 第179-180页 |
| 致谢 | 第180页 |
