| 目录 | 第1-6页 |
| 图表目录 | 第6-7页 |
| 中文摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 英文略语表 | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-18页 |
| 第一部分 SARS-CoV spike蛋白的表达纯化 | 第18-48页 |
| 1 实验材料 | 第18-23页 |
| ·质粒 | 第18页 |
| ·菌株 | 第18页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第18页 |
| ·主要化学试剂 | 第18-19页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第19页 |
| ·试剂盒 | 第19页 |
| ·主要仪器及设备 | 第19-20页 |
| ·主要溶液配方 | 第20-23页 |
| ·E.coli.常用培养基的配制 | 第20页 |
| ·制备感受态细胞相关溶液 | 第20页 |
| ·抗生素的配制 | 第20页 |
| ·大量提取质粒DNA的相关溶液 | 第20-21页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制 | 第21页 |
| ·细胞冻存液的配制 | 第21页 |
| ·蛋白质电泳及检测缓冲液 | 第21页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 | 第21-22页 |
| ·常用缓冲液的配制 | 第22页 |
| ·蛋白质分离纯化常用缓冲液的配制 | 第22-23页 |
| ·TEV site寡核苷酸序列的合成 | 第23页 |
| 2 实验方法 | 第23-35页 |
| ·单链复性 | 第23页 |
| ·酶切消化 | 第23-24页 |
| ·连接 | 第24-25页 |
| ·转化 | 第25页 |
| ·鉴定 | 第25页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| ·质粒DNA的小提 | 第26-27页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第27-29页 |
| ·重组质粒DNA浓度的测定 | 第29页 |
| ·DNA的纯化回收 | 第29页 |
| ·贴壁细胞的培养 | 第29页 |
| ·稳定表达细胞株的构建 | 第29-30页 |
| ·细胞冻存 | 第30页 |
| ·细胞复苏 | 第30页 |
| ·ELISA检测方法 | 第30-31页 |
| ·用TEV酶切消化,去掉蛋白标签 | 第31-32页 |
| ·Western Blotting的检测方法 | 第32-33页 |
| ·蛋白提纯 | 第33-34页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第34-35页 |
| 3 实验结果 | 第35-46页 |
| ·优化合成S蛋白编码基因 | 第35-37页 |
| ·将TEV酶切位点插入载体,改造质粒 | 第37-39页 |
| ·构建SARS-CoV S蛋白基因的重组质粒 | 第39页 |
| ·重组质粒的瞬时表达检测 | 第39-40页 |
| ·建立表达S1190-TEV-Fc融合蛋白的恒定表达细胞株 | 第40-41页 |
| ·ELISA检测比较恒定表达细胞株中重组蛋白的表达量 | 第41-42页 |
| ·S1190-TEV-Fc融合蛋白的提纯 | 第42-43页 |
| ·提纯后的S1190-TEV-Fc融合蛋白经TEV酶切检测 | 第43-44页 |
| ·S1190蛋白活性的检测 | 第44-46页 |
| 讨论 | 第46-48页 |
| 第二部分 SARS-CoV Spike蛋白的受体结合结构域通过病毒受体ACE2能够单独进入细胞 | 第48-82页 |
| 4 实验材料 | 第48-50页 |
| ·细胞 | 第48页 |
| ·主要仪器及设备 | 第48页 |
| ·其他化学试剂 | 第48-49页 |
| ·主要溶液配方 | 第49页 |
| ·细胞裂解液的配制 | 第49页 |
| ·细胞免疫染色实验缓冲液的配制 | 第49页 |
| ·PCR引物 | 第49-50页 |
| 5 实验方法 | 第50-56页 |
| ·PCR扩增 | 第50页 |
| ·PCR产物的纯化回收 | 第50-51页 |
| ·细胞裂解 | 第51页 |
| ·用流式细胞技术检测表达重组蛋白的活性 | 第51-52页 |
| ·IP实验 | 第52-53页 |
| ·用流式细胞技术检测RBD S蛋白内吞实验 | 第53页 |
| ·RBD-Fc蛋白的去糖基化实验 | 第53-54页 |
| ·荧光显微镜实验 | 第54页 |
| ·细胞免疫荧光实验 | 第54-55页 |
| ·统计学分析 | 第55-56页 |
| 6 实验结果 | 第56-73页 |
| ·优化RBD基因 | 第56-57页 |
| ·构建RBD表达载体 | 第57-58页 |
| ·通过瞬时转染检测RBD的表达 | 第58-59页 |
| ·稳定表达RBD-Fc的细胞株的构建 | 第59-60页 |
| ·RBD-Fc蛋白的分离和纯化 | 第60-61页 |
| ·RBD与受体ACE2免疫共沉淀(IP)的实验结果 | 第61-62页 |
| ·通过流式细胞术检测纯化的RBD-Fc蛋白的活性 | 第62-64页 |
| ·RBD能够内吞进入易感细胞 | 第64-68页 |
| ·RBD转位到EEA1阳性的早胞内体 | 第68-69页 |
| ·去除N连接的糖基化不能消除RBD蛋白通过病毒受体ACE2进入易感细胞 | 第69-73页 |
| 讨论 | 第73-76页 |
| 小结 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-82页 |
| 第三部分 myostatin在哺乳动物细胞中的表达 | 第82-87页 |
| 前言 | 第82-84页 |
| 7 实验方法 | 第84页 |
| 8 实验结果 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-87页 |
| 综述:SARS-CoV的研究进展 | 第87-108页 |
| 1.病毒受体的确认 | 第88-89页 |
| ·ACE2是SARS-CoV的功能受体 | 第88页 |
| ·CD209L(L-SIGN)也是SARS-CoV的受体 | 第88-89页 |
| 2.病毒进入 | 第89-93页 |
| ·直接膜融合 | 第89-90页 |
| ·内吞作用 | 第90-93页 |
| ·Clathrin介导的SARS-CoV内吞 | 第90-91页 |
| ·Cathepsin L与SARS-CoV进入 | 第91-92页 |
| ·Lipid raft与SARS-CoV进入 | 第92-93页 |
| 3 SARS-CoV致病机理 | 第93-100页 |
| ·SARS-CoV与RAS | 第93-95页 |
| ·SARS-CoV与凋亡 | 第95-97页 |
| ·SARS-CoV与机体的免疫反应 | 第97-100页 |
| ·SARS-CoV引发的固有性免疫反应 | 第97-98页 |
| ·SARS-CoV诱导的适应性免疫反应 | 第98-100页 |
| 参考文献 | 第100-108页 |
| 个人简历 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109页 |
