| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 引言 | 第11-22页 |
| 1 干扰素概况 | 第11-16页 |
| ·干扰素的产生和分类 | 第11页 |
| ·干扰素的分子生物学特性 | 第11-12页 |
| ·猪α干扰素生物学活性 | 第12-13页 |
| ·免疫调节作用 | 第12-13页 |
| ·抗病毒作用 | 第13页 |
| ·抑制细胞分裂活性 | 第13页 |
| ·猪α干扰素作用机制 | 第13-14页 |
| ·猪α干扰素的国内外研究进展 | 第14-16页 |
| 2 毕赤酵母表达系统的概述 | 第16-21页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优点 | 第16页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的构成 | 第16-18页 |
| ·表达载体的组成 | 第16-18页 |
| ·宿主菌 | 第18页 |
| ·毕赤酵母的转化方法 | 第18-19页 |
| ·影响外源蛋白表达水平的因素 | 第19-21页 |
| ·外源基因本身特性 | 第19页 |
| ·选择强启动子 | 第19页 |
| ·增加外源基因整合拷贝数 | 第19-20页 |
| ·优化酵母发酵条件 | 第20页 |
| ·提高菌株的生物密度 | 第20页 |
| ·产物稳定性 | 第20-21页 |
| 3 本研究的意义 | 第21-22页 |
| 1 材料 | 第22-26页 |
| ·组织、细胞及病毒 | 第22页 |
| ·菌株与质粒 | 第22页 |
| ·试剂盒 | 第22页 |
| ·抗体 | 第22页 |
| ·酶类试剂及其他相关试剂 | 第22-23页 |
| ·相关培养基 | 第23-25页 |
| ·SDS-PAGE与Western-Blot用试剂 | 第25页 |
| ·主要仪器 | 第25-26页 |
| 2 方法 | 第26-40页 |
| ·猪α干扰素成熟蛋白基因的PCR扩增、克隆和鉴定 | 第26-32页 |
| ·引物的设计与合成 | 第26页 |
| ·猪肝脏DNA的提取 | 第26-27页 |
| ·猪α干扰素成熟蛋白基因的PCR扩增 | 第27-28页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第28页 |
| ·猪α干扰素成熟蛋白基因与pMD18-Simple T Vector的连接 | 第28-29页 |
| ·DH_(5α)感受态细胞的制备 | 第29页 |
| ·连接产物转化DH_(5α)感受态细胞 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第30页 |
| ·重组质粒DNA的抽提 | 第30-31页 |
| ·重组质粒pMD-IFNα的酶切鉴定 | 第31页 |
| ·IFNα成熟蛋白基因片段的序列测定及测定结果分析 | 第31-32页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第32-34页 |
| ·重组质粒pMD-IFNα与表达载体pPICZαC质粒的双酶切 | 第32页 |
| ·双酶切产物的回收与纯化 | 第32页 |
| ·猪IFN-α成熟蛋白基因片段与载体质粒的连接 | 第32页 |
| ·连接产物转化 | 第32-33页 |
| ·重组表达质粒的菌液PCR鉴定 | 第33页 |
| ·重组表达质粒pPICZαC-IFNα的酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组表达质粒pPICZα C-IFNα的序列测定 | 第34页 |
| ·携带目的基因的重组酵母的构建 | 第34-35页 |
| ·毕赤酵母X33感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pPICZαC-IFNα的线性化及回收 | 第35页 |
| ·重组质粒pPICZαC-IFNα的电击转化 | 第35页 |
| ·高抗性整合子的初步诱导表达 | 第35-36页 |
| ·表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第36-37页 |
| ·灌制聚丙烯酰胺凝胶 | 第36页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| ·表达产物的Western-Blot检测 | 第37-38页 |
| ·表达产物的电转移 | 第37页 |
| ·转移蛋白的检测 | 第37-38页 |
| ·重组α干扰素的生物学活性检测 | 第38-40页 |
| ·伪狂犬病毒(PRV)的增殖与保存 | 第38页 |
| ·PRV的半数细胞感染量(TCID_(50))的测定 | 第38页 |
| ·干扰素抗病毒活性的测定 | 第38-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-48页 |
| ·猪α干扰素成熟蛋白基因的PCR扩增 | 第40页 |
| ·重组质粒的转化 | 第40页 |
| ·重组质粒pMD-IFNα的菌液PCR鉴定 | 第40页 |
| ·重组质粒pMD-IFNα的酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·猪α干扰素成熟蛋白基因的测序结果及同源性比较 | 第41-43页 |
| ·猪α干扰素成熟蛋白基因片段与表达载体pPICZα C质粒的连接 | 第43页 |
| ·重组表达质粒pPICZαC-IFNα的菌液PCR鉴定 | 第43页 |
| ·重组表达质粒pPICZαC-IFNα的酶切鉴定 | 第43-44页 |
| ·重组表达质粒pPICZα C-IFNα的序列测定结果 | 第44页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第44页 |
| ·表达产物的Western-Blot分析 | 第44-45页 |
| ·重组α干扰素的生物学活性检测结果 | 第45-48页 |
| ·PRV的半数细胞感染量(TCID_(50))的测定(Reed-Muench法) | 第45-46页 |
| ·BHK-21细胞上干扰素抗病毒活性的测定 | 第46-48页 |
| 4 讨论 | 第48-51页 |
| ·猪IFNα成熟蛋白基因的PCR引物设计 | 第48页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第48-49页 |
| ·影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素 | 第49页 |
| ·猪α干扰素的生物学活性测定 | 第49-50页 |
| ·抗病毒活性的检测系统 | 第49-50页 |
| ·抗猪伪狂犬病毒的活性测定 | 第50页 |
| ·下一步的工作计划 | 第50-51页 |
| 5 全文结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 附录 | 第57-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
