| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-15页 |
| 略语表 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-25页 |
| 前言 | 第16页 |
| 1 蜂王浆的组成及其功能 | 第16-19页 |
| ·蜂王浆的物理性质和化学成分 | 第17页 |
| ·蜂王浆的功能 | 第17-19页 |
| 2 王浆蛋白概述 | 第19-22页 |
| ·主要王浆蛋白 | 第19-21页 |
| ·其余王浆蛋白 | 第21-22页 |
| 3 研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 4 主要研究内容 | 第23-24页 |
| 5 实验流程图 | 第24-25页 |
| 第二章 AccMRJP2 全长基因的原核表达 | 第25-45页 |
| 1 材料与试剂 | 第25-29页 |
| ·材料 | 第25页 |
| ·试剂 | 第25页 |
| ·主要试剂的配制 | 第25-29页 |
| 2 方法 | 第29-42页 |
| ·AccMRJP2 全长基因的克隆 | 第29-40页 |
| ·AccMRJP2 基因cDNA 全长序列的获得 | 第29-30页 |
| ·AccMRJP2 基因的生物信息学分析 | 第30-34页 |
| ·序列分析 | 第30页 |
| ·疏水性分析 | 第30-31页 |
| ·信号肽分析 | 第31-32页 |
| ·跨膜结构域预测 | 第32页 |
| ·定位预测 | 第32-33页 |
| ·氨基酸序列的同源性分析 | 第33-34页 |
| ·PCR 扩增AccMRJP2 全长基因 | 第34-35页 |
| ·特异性引物的设计与合成 | 第34页 |
| ·PCR 扩增 | 第34-35页 |
| ·凝胶回收纯化PCR 产物 | 第35页 |
| ·目的片段与pET-28a(+)载体的双酶切及回收 | 第35-37页 |
| ·连接反应 | 第37页 |
| ·CaCl_2 法制备E.coli DH5α感受态细胞 | 第37页 |
| ·连接产物的转化 | 第37-38页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-AccMRJP2 的筛选与鉴定 | 第38-40页 |
| ·挑斑与质粒抽提 | 第38页 |
| ·PCR 鉴定重组质粒 | 第38-39页 |
| ·双酶切鉴定重组质粒 | 第39页 |
| ·重组质粒测序鉴定 | 第39页 |
| ·序列比对分析 | 第39-40页 |
| ·AccMRJP2 基因全长的诱导表达 | 第40-42页 |
| ·CaCl_2 法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第40页 |
| ·重组质粒的转化 | 第40页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-AccMRJP2 的筛选与鉴定 | 第40-41页 |
| ·挑斑、摇菌 | 第40页 |
| ·菌液PCR 鉴定 | 第40-41页 |
| ·His-AccMRJP2 重组蛋白的诱导表达 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测 | 第41-42页 |
| 3 结果 | 第42-44页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第42页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-AccMRJP2 的鉴定 | 第42-43页 |
| ·His-AccMRJP2 重组蛋白的诱导表达 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-45页 |
| 第三章 AccMRJP2 基因的分段原核表达 | 第45-59页 |
| 1 材料与试剂 | 第45页 |
| ·材料 | 第45页 |
| ·试剂 | 第45页 |
| ·主要试剂的配制 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-51页 |
| ·AccMRJP2 基因的分段克隆 | 第45-49页 |
| ·AccMRJP2 基因的cDNA 全长序列的获得 | 第45页 |
| ·PCR 扩增AccMRJP2 基因的各段序列 | 第45-47页 |
| ·特异性引物的设计与合成 | 第45-46页 |
| ·PCR 扩增 | 第46-47页 |
| ·凝胶回收纯化PCR 产物 | 第47页 |
| ·各目的片段与pET-28a(+)载体的双酶切与回收 | 第47-48页 |
| ·连接反应 | 第48页 |
| ·CaCl_2 法制备E.coli DH5α感受态细胞 | 第48页 |
| ·连接产物的转化 | 第48页 |
| ·各重组质粒的筛选与鉴定 | 第48-49页 |
| ·挑斑与质粒抽提 | 第48页 |
| ·PCR 鉴定各重组质粒 | 第48-49页 |
| ·双酶切鉴定重组质粒 | 第49页 |
| ·重组质粒测序鉴定 | 第49页 |
| ·序列比对分析 | 第49页 |
| ·AccMRJP2 基因的分段诱导表达 | 第49-50页 |
| ·CaCl_2 法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第49页 |
| ·重组质粒的转化 | 第49页 |
| ·各重组质粒的筛选与鉴定 | 第49-50页 |
| ·挑斑、摇菌 | 第49页 |
| ·菌液PCR 鉴定 | 第49-50页 |
| ·融合蛋白His-420、His-486、His-498 和His-1356 的诱导表达 | 第50页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测 | 第50页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第50-51页 |
| 3 结果 | 第51-57页 |
| ·PCR 扩增各目的基因 | 第51-52页 |
| ·各重组质粒的构建 | 第52页 |
| ·融合蛋白His-420、His-486、His-498 和His-1356 的诱导表达 | 第52-55页 |
| ·不加诱导剂(IPTG)的融合蛋白His-498 和His-1356 的表达 | 第53页 |
| ·加诱导剂(IPTG)的融合蛋白His-498 和His-1356 的表达 | 第53-54页 |
| ·融合蛋白His-420 和His-486 的表达 | 第54-55页 |
| ·融合蛋白诱导表达条件的优化 | 第55-57页 |
| ·His-498 融合蛋白表达条件的优化 | 第55-56页 |
| ·融合蛋白表达条件的优化 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-59页 |
| 第四章 AccMRJP2 重组蛋白的纯化及质谱分析 | 第59-71页 |
| 1 材料与试剂 | 第59-60页 |
| ·材料 | 第59页 |
| ·主要试剂的配制 | 第59-60页 |
| 2 方法 | 第60-64页 |
| ·重组蛋白的亲和纯化 | 第60-63页 |
| ·重组蛋白的表达存在形式分析 | 第60-61页 |
| ·包涵体的溶解 | 第61页 |
| ·Ni-NTA 柱亲和纯化重组蛋白 | 第61-62页 |
| ·Ni-NTA 亲和层析柱的再生 | 第62-63页 |
| ·重组蛋白的FPLC 纯化和质谱分析 | 第63-64页 |
| ·重组蛋白的FPLC 纯化 | 第63页 |
| ·重组蛋白的鉴定 | 第63页 |
| ·重组蛋白的酶解 | 第63-64页 |
| ·重组蛋白酶解肽段的质谱分析 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-69页 |
| ·重组蛋白的大量表达及包涵体的处理 | 第64-65页 |
| ·His-420 和His-498 包涵体的处理 | 第64-65页 |
| ·His-486 包涵体的处理 | 第65页 |
| ·His-420、His-486 和His-498 融合蛋白的纯化 | 第65-67页 |
| ·His-486 融合蛋白的纯化 | 第65-66页 |
| ·His-498 融合蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| ·FPLC 纯化及质谱分析 | 第67-69页 |
| ·重组蛋白的质谱鉴定 | 第67页 |
| ·重组蛋白酶解多肽的质谱分析结果 | 第67-69页 |
| ·His-420 融合蛋白的质谱图 | 第68页 |
| ·His-486 融合蛋白的质谱图 | 第68-69页 |
| ·His-498 融合蛋白的质谱图 | 第69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 结论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
