| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 英文缩略表 | 第12-14页 |
| 1 引言 | 第14-30页 |
| ·RNA介导的抗病性 | 第14-17页 |
| ·RNA介导的抗病性的特点 | 第14-15页 |
| ·RNA介导的抗性是转录后基因沉默的结果 | 第15-17页 |
| ·RNA沉默(RNA silencing) | 第17-25页 |
| ·RNA沉默的组分 | 第17-23页 |
| ·RdRP(RNAdepenbdent RNA polymerase) | 第17-18页 |
| ·Dicer酶 | 第18-20页 |
| ·RNA诱导的沉默复合体(PdSC) | 第20-21页 |
| ·PTGS的辅助蛋白 | 第21-22页 |
| ·小分子RNA的种类 | 第22-23页 |
| ·RNAi的机制 | 第23-25页 |
| ·发夹RNA(hpRNA)与RNA介导的基因沉默 | 第25-26页 |
| ·RNAi的应用前景 | 第26-28页 |
| ·RNAi在植物抗病毒育种中的作用 | 第26-27页 |
| ·植物基因功能的分析 | 第27-28页 |
| ·基因治疗 | 第28页 |
| ·本研究的立题依据和主要研究内容 | 第28-30页 |
| ·立题依据 | 第28-29页 |
| ·本研究主要研究内容 | 第29-30页 |
| 2 材料与方法 | 第30-46页 |
| ·材料 | 第30页 |
| ·毒源 | 第30页 |
| ·供试植物 | 第30页 |
| ·菌株、质粒 | 第30页 |
| ·常用缓冲液及培养基的配制 | 第30页 |
| ·常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第30页 |
| ·方法 | 第30-46页 |
| ·PVY~N-CP反向重复结构目的片段的获得 | 第30-32页 |
| ·引物设计 | 第30-31页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第31-32页 |
| ·克隆载体构建 | 第32-36页 |
| ·质粒DNA和目的片段的酶切 | 第32-33页 |
| ·质粒DNA与目的片段DNA的连接 | 第33-34页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·质粒DNA向大肠杆菌中转化(热激法) | 第34页 |
| ·转化菌落PCR鉴定 | 第34-35页 |
| ·质粒DNA的大量提取(碱裂解法)： | 第35-36页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第36页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第36-38页 |
| ·植物表达载体的构建策略 | 第36-38页 |
| ·目的片段与植物表达载体的连接 | 第38页 |
| ·重组质粒向大肠杆菌的转化 | 第38页 |
| ·重组质粒向农杆菌转化(冻融法) | 第38页 |
| ·目的基因向烟草中的转化及植株再生 | 第38-39页 |
| ·植物总DNA的提取(CTAB法)及PCR检测 | 第39-40页 |
| ·植物总DNA的提取(CTAB法) | 第39页 |
| ·转基因植株的PCR检测 | 第39-40页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定及ELISA检测 | 第40页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定 | 第40页 |
| ·ELISA检测 | 第40页 |
| ·转基因植物的Southern blot分析 | 第40-43页 |
| ·植物总DNA的酶切 | 第40-41页 |
| ·DNA凝胶电泳 | 第41页 |
| ·转膜 | 第41-42页 |
| ·探针的制备 | 第42-43页 |
| ·DNA片段的获得 | 第42页 |
| ·PCR扩增产物的纯化 | 第42页 |
| ·准备模板 | 第42页 |
| ·合成反应 | 第42-43页 |
| ·杂交 | 第43页 |
| ·转基因植株总RNA的提取及Northern blot分析 | 第43-46页 |
| ·植物总RNA的提取(异硫氢酸胍法) | 第43-44页 |
| ·在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳 | 第44-45页 |
| ·转膜 | 第45页 |
| ·探针制备 | 第45页 |
| ·杂交 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-62页 |
| ·目的片段的获得 | 第46-47页 |
| ·目的片段的扩增和酶切 | 第46页 |
| ·质粒DNA酶切 | 第46-47页 |
| ·重组克隆载体的构建 | 第47-51页 |
| ·第一条片段与克隆载体的连接 | 第47页 |
| ·重组中间载体的菌落PCR鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组中间载体酶切鉴定 | 第48页 |
| ·第二条片段与中间载体的连接 | 第48页 |
| ·重组中间载体的菌落PCR鉴定 | 第48-49页 |
| ·重组中间载体酶切鉴定 | 第49-51页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第51-53页 |
| ·目的片段的酶切 | 第51页 |
| ·目的片段与植物表达载体的连接 | 第51页 |
| ·重组表达载体的菌落PCR鉴定 | 第51-52页 |
| ·重组表达载体酶切鉴定 | 第52-53页 |
| ·转化植株的获得 | 第53-54页 |
| ·转化植株的PCR检测 | 第54-56页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第56-59页 |
| ·转基因植株的Southern blot分析 | 第59-61页 |
| ·转基因(非转基因)植株DNA的酶切 | 第59页 |
| ·转基因烟草的Southern blot分析 | 第59-61页 |
| ·转基因植株的Northern blot分析 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-65页 |
| ·发夹RNA与RNA介导的抗病性研究 | 第62-63页 |
| ·PVY~N-CP 5′端和3′端相同片段长度转化烟草的抗病性研究 | 第63-65页 |
| 5 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-78页 |
| 附录Ⅰ 常用缓冲液及培养基的配制 | 第78-84页 |
| 50×TAE缓冲液 | 第78页 |
| 植物DNA SDS抽提液 | 第78页 |
| 植物DNA CTAB抽提液 | 第78页 |
| 5×甲醛凝胶电泳缓冲液(DEPC处理水配制) | 第78页 |
| 甲醛凝胶加样缓冲液(DEPC处理水配制) | 第78-79页 |
| 甲醛变性凝胶配方 | 第79页 |
| TE缓冲液 | 第79页 |
| ELISA包被液(碳酸缓冲液) | 第79页 |
| 底物缓冲液 | 第79页 |
| ·mol／L PBS缓冲液 | 第79页 |
| ELISA洗涤液(0.01mol／L PBST) | 第79-80页 |
| ELISA封闭液 | 第80页 |
| LB液体培养基 | 第80页 |
| YEP液体培养基 | 第80页 |
| 10％SDS(500ml) | 第80页 |
| 20×SSC | 第80页 |
| 杂交液 | 第80-81页 |
| 植物RNA提取缓冲液 | 第81页 |
| 植物RNA溶解缓冲液 | 第81页 |
| 1号溶液(1L)(质粒DNA提取用) | 第81页 |
| 2号溶液(质粒DNA提取用) | 第81页 |
| 3号溶液(100ml) | 第81页 |
| ·mol／L PB缓冲液(PH7.5) | 第81页 |
| MS大量元素(20×1000ml) | 第81-82页 |
| MS微量元素(100×500ml) | 第82页 |
| MS维生素(100×500ml) | 第82页 |
| MS培养基 | 第82页 |
| MS分化培养基 | 第82页 |
| MS生根培养基 | 第82-83页 |
| MS选择培养基 | 第83-84页 |
| 附录Ⅱ 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第84-86页 |
| 附录Ⅲ 质粒图谱 | 第86-89页 |
| 植物表达载体pROKⅡ图谱 | 第86-87页 |
| 植物表达载体pROKⅡ酶切图谱 | 第87-88页 |
| 克隆载体pUC19图谱 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 硕士研究生阶段发表的论文 | 第90页 |
