| 中文摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-5页 |
| 引言 | 第5页 |
| 材料和方法 | 第5-17页 |
| 一. 人肾近曲小管细胞原代培养 | 第5-6页 |
| (一)取材、细胞分离与培养 | 第5-6页 |
| (二)培养细胞的观察与鉴定 | 第6页 |
| 二. 293细胞培养 | 第6-7页 |
| 三.RT-PCR扩增293细胞中的E1A基因 | 第7-10页 |
| (一)293细胞mRNA抽提 | 第7页 |
| (二)RT-PCR | 第7-10页 |
| 四. DCR产物双酶切及目的片段回收 | 第10-11页 |
| (一)PCR产物双酶切(所有内切酶均购自TaKaRa公司) | 第10-11页 |
| (二)酶切产物胶回收 | 第11页 |
| 六.酶切的PCR片段与载体P-Shuttle CMV的连接 | 第11-12页 |
| 七. 连接产物转化、筛选及测序 | 第12-13页 |
| 八.重组质粒的大量制备 | 第13页 |
| 九.细胞培养及质粒基因细胞转化 | 第13-14页 |
| 十.转化细胞的鉴定 | 第14-15页 |
| (一)RT-PCR鉴定ad5E1A基因表达 | 第14页 |
| (二)免疫荧光测定ad5E1A蛋白表达 | 第14-15页 |
| 十一. 转化细胞的功能测定 | 第15-17页 |
| (一)MTT法测定细胞生长曲线 | 第15页 |
| (二)流式细胞光度术PI(碘化丙锭)染色法检测细胞周期 | 第15-16页 |
| (三)转化细胞的酶学功能检测 | 第16-17页 |
| 结果 | 第17-24页 |
| 一.人肾近曲小管上皮细胞原代培养及鉴定 | 第17-18页 |
| 二.PT-PCR扩增ad5E1A基因 | 第18-19页 |
| 三.载体的重组构建 | 第19-20页 |
| 四.转化细胞的鉴定 | 第20-21页 |
| 1.RT-PCR扩增目的基因 | 第20页 |
| 2.免疫荧光检测转化后细胞ad5E1A的蛋白表达 | 第20-21页 |
| 五.细胞功能测定 | 第21-24页 |
| 1.转化后细胞增殖速率的变化 | 第21页 |
| 2.转化后细胞的细胞周期变化 | 第21-23页 |
| 3.细胞酶学功能检测 | 第23-24页 |
| 分析与讨论 | 第24-29页 |
| 小结 | 第29页 |
| 参考文献 | 第29-32页 |
| 附1 | 第32-40页 |
| 综述 基因转染在生物人工肾小管中的研究 | 第32-40页 |
| 附2 | 第40页 |
| 致谢 | 第40页 |
