| 中文摘要 | 第1-4页 |
| 英文摘要 | 第4-11页 |
| 缩略词 | 第11-13页 |
| 1 绪论 | 第13-22页 |
| ·锌指蛋白基因研究进展 | 第13-18页 |
| ·锌指蛋白的特点和分类 | 第13-14页 |
| ·锌指蛋白的作用方式 | 第14-15页 |
| ·与逆境胁迫相关的植物锌指蛋白 | 第15-18页 |
| ·CCCH 类型锌指蛋白的研究进展 | 第18页 |
| ·基因功能鉴定的方法 | 第18-21页 |
| ·微阵列分析 | 第18-19页 |
| ·基因转导技术 | 第19页 |
| ·反义技术 | 第19页 |
| ·基因敲除和转基因技术 | 第19-20页 |
| ·基因敲入 | 第20页 |
| ·人工染色体的转导 | 第20页 |
| ·RNA 干涉（RNA interference, RNAi） | 第20-21页 |
| ·基因诱捕技术 | 第21页 |
| ·本研究的目的、内容及意义 | 第21-22页 |
| 2 紫花苜蓿锌指蛋白 MsZFN 基因的克隆 | 第22-37页 |
| ·材料 | 第22-25页 |
| ·植物材料和E. coli 菌株 | 第22页 |
| ·生化试剂 | 第22-23页 |
| ·引物 | 第23页 |
| ·3′-RACE 原理 | 第23-24页 |
| ·5′-RACE 原理 | 第24-25页 |
| ·方法 | 第25-28页 |
| ·材料的获取 | 第25页 |
| ·总RNA 提取(TRIzol 法) | 第25页 |
| ·制备3′-RACE-Ready 和5′-RACE-Ready cDNA | 第25-26页 |
| ·3′-RACE 和5′-RACE | 第26页 |
| ·PCR 产物的切胶回收 | 第26-27页 |
| ·载体连接 | 第27页 |
| ·连接产物的转化 | 第27页 |
| ·单克隆挑取、培养及PCR 检测 | 第27-28页 |
| ·结果与分析 | 第28-35页 |
| ·紫花苜蓿总RNA 的提取 | 第28页 |
| ·与大豆锌指蛋白基因同源的EST 序列及引物设计 | 第28-29页 |
| ·基因3′端序列的克隆 | 第29-30页 |
| ·基因5′端序列的克隆 | 第30-31页 |
| ·MsZFN 基因的cDNA 全序列的获得及序列分析 | 第31-33页 |
| ·MsZFN 蛋白序列分析 | 第33-34页 |
| ·密码子统计与分析 | 第34-35页 |
| ·讨论 | 第35-36页 |
| ·小结 | 第36-37页 |
| 3 MsZFN 基因的表达分析 | 第37-41页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-38页 |
| ·引物设计 | 第37页 |
| ·材料的获取 | 第37页 |
| ·实时荧光定量PCR 检测 | 第37-38页 |
| ·结果与分析 | 第38-39页 |
| ·MsZFN 基因在不同组织中的表达分析 | 第38页 |
| ·盐胁迫时间对MsZFN 基因表达的影响 | 第38-39页 |
| ·黑暗条件对MsZFN 基因表达的影响 | 第39页 |
| ·讨论 | 第39-40页 |
| ·小结 | 第40-41页 |
| 4 MsZFN 基因超表达载体的构建及转化 | 第41-47页 |
| ·材料 | 第41-42页 |
| ·植物材料和菌株 | 第41页 |
| ·载体 | 第41页 |
| ·培养基的配置 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-44页 |
| ·引物设计 | 第42页 |
| ·表达载体的构建 | 第42页 |
| ·农杆菌感受态的制备 | 第42-43页 |
| ·农杆菌转化及鉴定 | 第43页 |
| ·紫花苜蓿的转化 | 第43页 |
| ·烟草转化（叶盘法） | 第43-44页 |
| ·结果与分析 | 第44-46页 |
| ·表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·重组载体的鉴定 | 第45页 |
| ·再生植株的获得 | 第45-46页 |
| ·讨论 | 第46页 |
| ·小结 | 第46-47页 |
| 5 MsZFN 基因 RNA 干扰植物载体构建及对苜蓿的转化 | 第47-52页 |
| ·材料 | 第47页 |
| ·植物材料和菌株 | 第47页 |
| ·载体 | 第47页 |
| ·培养基 | 第47页 |
| ·方法 | 第47-48页 |
| ·引物设计 | 第47页 |
| ·表达载体的构建 | 第47-48页 |
| ·农杆菌感受态的制备、转化及鉴定 | 第48页 |
| ·紫花苜蓿的转化 | 第48页 |
| ·结果与分析 | 第48-50页 |
| ·RNA 干扰植物表达载体构建及鉴定 | 第48-50页 |
| ·苜蓿再生植株获得 | 第50页 |
| ·讨论 | 第50-51页 |
| ·小结 | 第51-52页 |
| 6 再生植株的转基因检测 | 第52-58页 |
| ·材料 | 第52页 |
| ·植物材料 | 第52页 |
| ·生化试剂 | 第52页 |
| ·溶液的配制 | 第52页 |
| ·方法 | 第52-53页 |
| ·基因组DNA 提取 | 第52-53页 |
| ·再生烟草总RNA 提取及反转录 | 第53页 |
| ·再生植株PCR 检测 | 第53页 |
| ·再生烟草植株的RT-PCR 检测 | 第53页 |
| ·结果与分析 | 第53-56页 |
| ·苜蓿再生植株PCR 检测 | 第53-54页 |
| ·烟草再生植株检测 | 第54-55页 |
| ·再生烟草植株PCR-Southern 检测 | 第55-56页 |
| ·RNAi 转化苜蓿PCR 检测 | 第56页 |
| ·讨论 | 第56-58页 |
| 7 MsZFN 原核表达及亚细胞定位 | 第58-66页 |
| ·材料 | 第58-59页 |
| ·大肠杆菌菌株 | 第58页 |
| ·质粒载体 | 第58页 |
| ·引物设计 | 第58页 |
| ·工具酶和主要试剂 | 第58页 |
| ·溶液配制 | 第58-59页 |
| ·方法 | 第59-61页 |
| ·重组子pET-ZFN 构建 | 第59-60页 |
| ·重组子MsZFN-GFP 构建 | 第60页 |
| ·重组质粒pET-ZFN 融合蛋白的诱导表达 | 第60页 |
| ·融合蛋白表达的电泳鉴定 | 第60页 |
| ·凝胶的染色和脱色 | 第60页 |
| ·金粉悬液制备 | 第60-61页 |
| ·子弹制备 | 第61页 |
| ·重组子MsZFN-GFP 转化洋葱及检测 | 第61页 |
| ·结果 | 第61-64页 |
| ·MsZFN 基因原核表达载体pET-ZFN 构建及鉴定 | 第61-62页 |
| ·MsZFN 融合蛋白诱导表达 | 第62-63页 |
| ·MsZFN 基因亚细胞定位瞬时表达载体构建及鉴定 | 第63-64页 |
| ·MsZFN-GFP 转化洋葱表皮细胞 | 第64页 |
| ·讨论 | 第64-66页 |
| 8 结论与展望 | 第66-67页 |
| ·结论 | 第66页 |
| ·创新点 | 第66页 |
| ·后续研究工作展望 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 附录 | 第72页 |
