| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-19页 |
| 1 水稻瘤矮病毒的研究现状 | 第12-15页 |
| ·水稻瘤矮病毒病的发生和流行 | 第12页 |
| ·水稻瘤矮病毒基因组结构与功能 | 第12-14页 |
| ·水稻病毒的蛋白互作研究现状 | 第14-15页 |
| 2 酵母双杂交系统原理及其用途 | 第15-17页 |
| ·酵母双杂交系统的原理 | 第15-16页 |
| ·酵母双杂交系统的主要用途 | 第16-17页 |
| 3 激光共聚焦技术的原理及用途 | 第17页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第17-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-33页 |
| 1 酵母双杂交验证 P3 蛋白与 Pns9 蛋白的互作 | 第19-26页 |
| ·材料 | 第19页 |
| ·实验材料 | 第19页 |
| ·菌株和质粒 | 第19页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·实验方法 | 第19-26页 |
| ·水稻叶片总RNA 的提取 | 第19-20页 |
| ·RGDV S3、S9 基因的RT-PCR 扩增 | 第20-21页 |
| ·S3、S9 目的基因纯化 | 第21页 |
| ·S3、S9 目的基因连接 pMD18-T 载体 | 第21页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备以及转化 | 第21-22页 |
| ·鉴定重组质粒 | 第22-23页 |
| ·S3、S9 基因酵母双杂交载体的构建 | 第23-24页 |
| ·酵母双杂交检测 S3 与 S9 蛋白两两互作情况 | 第24-26页 |
| 2 双分子荧光互补技术的应用进一步验证 S3 与 S9 蛋白互作 | 第26-29页 |
| ·材料 | 第26页 |
| ·注射烟草 | 第26页 |
| ·菌株和质粒 | 第26页 |
| ·主要试剂 | 第26页 |
| ·方法 | 第26-29页 |
| ·S3、S9 基因PCR 扩增和检测回收 | 第26页 |
| ·YGFP-S9 基因的克隆并鉴定 | 第26页 |
| ·Bifc 载体的构建 | 第26-27页 |
| ·重组Bifc 载体转化农杆菌步骤 | 第27-28页 |
| ·Bifc 载体表达情况烟草叶片中 | 第28-29页 |
| 3 酵母双杂交技术确定水稻瘤矮病毒 P3 与 Pns9蛋白间的互作的区域 | 第29-31页 |
| ·材料 | 第29页 |
| ·菌株 | 第29页 |
| ·主要试剂 | 第29页 |
| ·主要步骤 | 第29-31页 |
| ·目的基因S3-N1，S3-N2，S3-N3 和S9-N1，S9-N2，S9-N3 的PCR 扩增 | 第29页 |
| ·扩增产物S3-N1，S3-N2，S3-N3 和S9-N1，S9-N2，S9-N3 的检测和回收 | 第29页 |
| ·目的基因S9-N1，S9-N2，S9-N3 的克隆载体构建 | 第29页 |
| ·目的基因S3-N1，S3-N2，S3-N3 和S9-N1，S9-N2，S9-N3 构建酵母双杂交载体 | 第29-30页 |
| ·S3，S3-N1，S3-N2，S3-N3 和S9，S9-N1，S9-N2，S9-N3 蛋白自激活的活性检测 | 第30页 |
| ·酵母双杂交来寻找P3 与Pns9 蛋白互作区域 | 第30-31页 |
| 4 酵母双杂交技术筛选水稻瘤矮病毒 P3 蛋白与水稻互作的蛋白 | 第31-33页 |
| ·实验材料 | 第31页 |
| ·菌株和主要试剂 | 第31页 |
| ·实验方法 | 第31-32页 |
| ·制备筛选水稻文库的酵母感受态细胞 | 第31页 |
| ·转化反应步骤 | 第31-32页 |
| ·提取酵母双杂系统阳性克隆酵母质粒 | 第32页 |
| ·酵母质粒DNA 电转化大肠杆菌 | 第32页 |
| ·提取水稻总RNA，引物扩增酵母双杂合系统筛选的阳性克隆 | 第32页 |
| ·构建Bifc 载体验证筛选的阳性克隆 | 第32页 |
| ·激光共聚焦显微镜观察 | 第32-33页 |
| 第三章 结果与分析 | 第33-50页 |
| 1 酵母双杂交验证P3 蛋白与Pns9 蛋白的互作 | 第33-37页 |
| ·RGDV S3、S9 基因RT-PCR 扩增 | 第33页 |
| ·S3、S9 基因重组克隆载体的PCR，酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·S3、S9 基因酵母表达载体的构建 | 第34-35页 |
| ·S3 和S9 自激活作用的检测 | 第35-36页 |
| ·检测S3 与S9 蛋白在酵母中两两互作情况 | 第36-37页 |
| 2 双分子荧光互补技术进一步验证S3 与S9 蛋白互作 | 第37-41页 |
| ·S3、S9 基因PCR 扩增和检测回收 | 第37页 |
| ·鉴定和YGFP-S9 基因的克隆 | 第37-38页 |
| ·Bifc 载体的构建 | 第38-39页 |
| ·目的基因S3 和S9 在烟草悬浮细胞中的表达及观察 | 第39-41页 |
| 3 RGDV S3 与S9 互作区域的确定 | 第41-47页 |
| ·S3 与S9 基因的PCR 扩增获突变体 | 第41-42页 |
| ·S9-N1、S9-N2、S9-N3 突变体基因的克隆 | 第42页 |
| ·构建S3-N1、S3-N2、S3-N3、S9-N1、S9-N2、S9-N3 突变体的酵母表达载体 | 第42-44页 |
| ·S3，S3-N1，S3-N2，S3-N3 和S9，S9-N1，S9-N2，S9-N3 蛋白自激活活性检测结果 | 第44-46页 |
| ·S3 与S9 互作区间 | 第46-47页 |
| 4 酵母双杂交筛选水稻瘤矮病毒P3 蛋白与水稻文库cDNA 互作的蛋白 | 第47-50页 |
| ·筛选出水稻瘤矮病毒P3 蛋白与水稻文库cDNA 互作的蛋白ASP | 第47-48页 |
| ·提取水稻总RNA，引物扩增目的片段水稻基因 | 第48-49页 |
| ·构建筛选的水稻基因的重组 Bifc 载体 | 第49页 |
| ·激光共聚焦观察 ASP 蛋白与 P3 蛋白互作结果 | 第49-50页 |
| 第四章 问题与讨论 | 第50-54页 |
| 1 酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证 P3 与 Pns9 蛋白的互作 | 第50-51页 |
| 2 酵母双杂交技术确定水稻瘤矮病毒 P3 与 Pns9 蛋白互作的活性部位 | 第51-52页 |
| 3 酵母双杂交技术筛选水稻瘤矮病毒 P3 蛋白与水稻蛋白互作 | 第52-54页 |
| 第五章 全文总结与展望 | 第54-55页 |
| 攻硕期间发表及(拟)投稿的文章 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 附录和附表 | 第62页 |
| 附录一 本研究所用的试剂与溶液的配制 | 第62-64页 |
| 附录二 本研究所用试剂与溶液的配制 | 第64-65页 |
| 附录三 缩写词和专业词解释 | 第65-67页 |
| 附录四 分析 RGDV P3 和 Pns9 蛋白结构域设计相应的突变体 | 第67-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
