| Contents | 第9-14页 |
| 摘要 | 第14-15页 |
| ABSTRACT | 第15-16页 |
| 符号说明 | 第17-19页 |
| 第一章 前言 | 第19-31页 |
| 1. 萜类化合物生物合成途径 | 第19-20页 |
| 2. 克隆策略 | 第20-23页 |
| 2.1. 同源序列克隆法 | 第20-21页 |
| 2.2. 染色体步移法 | 第21页 |
| 2.3. 基于生物合成途径的筛选 | 第21-22页 |
| 2.4. 基因组挖掘 | 第22-23页 |
| 3. 微生物萜类合酶 | 第23-29页 |
| 3.1. 真菌 | 第23-26页 |
| 3.2. 细菌 | 第26-29页 |
| 4. 晶体结构 | 第29-30页 |
| 5. 研究展望 | 第30-31页 |
| 第二章 链霉菌Streptomyces sp.LZ35菌株的二萜合酶基因的研究 | 第31-80页 |
| 前言 | 第31页 |
| 第一节 二萜合酶cyclooctatin synthase表达体系的构建 | 第31-40页 |
| 1. 实验材料 | 第31-33页 |
| 1.1. 菌株和质粒 | 第31-32页 |
| 1.2. 引物 | 第32页 |
| 1.3. 试剂 | 第32页 |
| 1.4. 仪器 | 第32-33页 |
| 2. 方法 | 第33-38页 |
| 2.1. PCR反应 | 第33-35页 |
| 2.2. PCR产物(或载体)酶切,酶连反应 | 第35-36页 |
| 2.3. DNA片段的回收 | 第36页 |
| 2.4. 大肠杆菌质粒DNA的小量提取 | 第36页 |
| 2.5. 大肠杆菌化学感受态细胞制备 | 第36-37页 |
| 2.6. 质粒DNA的转化(氯化钙法) | 第37页 |
| 2.7. DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第37-38页 |
| 3. 实验结果 | 第38-40页 |
| 3.1. native二萜合酶 | 第38-39页 |
| 3.2. Se-Met二萜合酶 | 第39-40页 |
| 第二节 二萜合酶CYC的蛋白表达和纯化 | 第40-52页 |
| 1. 实验材料 | 第40-43页 |
| 1.1. 常用试剂及配制 | 第40-41页 |
| 1.2. 培养基 | 第41页 |
| 1.3. 缓冲液配制 | 第41-42页 |
| 1.4. 实验仪器 | 第42-43页 |
| 2. 实验方法 | 第43-45页 |
| 2.1. 蛋白异源表达和纯化 | 第43-44页 |
| 2.2. 蛋白SDS-PAGE电泳 | 第44-45页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第45-52页 |
| 3.1. native CYC蛋白的表达、纯化 | 第45-48页 |
| 3.2. Se-Met CYC蛋白衍生物的制备 | 第48-52页 |
| 第三节 二萜合酶CYC晶体的获得和结构解析 | 第52-61页 |
| 1. 实验材料 | 第52-53页 |
| 1.1. 蛋白结晶用试剂和材料 | 第52页 |
| 1.2. 晶体衍射收集数据用仪器和材料 | 第52-53页 |
| 2. 蛋白质结晶实验方法 | 第53-54页 |
| 2.1. 晶体初筛方法：气相扩散技术(Vapor Diffusion Method) | 第53页 |
| 2.2. 晶体优化方法 | 第53-54页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第54-61页 |
| 3.1. CYC蛋白质晶体的获得 | 第54-57页 |
| 3.2. 晶体结构解析 | 第57-61页 |
| 第四节 CYC蛋白与底物共结晶 | 第61-63页 |
| 1. 实验材料 | 第61页 |
| 2. 实验仪器 | 第61页 |
| 3. 实验方法 | 第61页 |
| 4. 实验结果与讨论 | 第61-63页 |
| 4.1. 底物类似物纯化 | 第61页 |
| 4.2. 共结晶 | 第61-63页 |
| 第五节 二萜合酶基因cyc的过表达 | 第63-69页 |
| 1. 实验材料 | 第63-65页 |
| 1.1. 菌株 | 第63-64页 |
| 1.2. 引物 | 第64页 |
| 1.3. 试剂 | 第64-65页 |
| 1.4. 培养基 | 第65页 |
| 1.5. 实验仪器 | 第65页 |
| 2. 实验方法 | 第65-67页 |
| 2.1. 分子生物学 | 第65页 |
| 2.2. 菌株的培养及保藏 | 第65页 |
| 2.3. 质粒DNA电转化 | 第65-66页 |
| 2.4. 链霉菌基因组DNA快速提取 | 第66页 |
| 2.5. 链霉菌孢子悬液的制备 | 第66页 |
| 2.6. 接合转移 | 第66-67页 |
| 3. 实验结果 | 第67-69页 |
| 第六节 二萜类天然产物的提取纯化 | 第69-78页 |
| 1. 实验材料 | 第70-71页 |
| 1.1. 试剂 | 第70页 |
| 1.2. 常用显色剂 | 第70页 |
| 1.3. 实验仪器 | 第70-71页 |
| 2. 发酵用培养基 | 第71页 |
| 3. 实验方法 | 第71-72页 |
| 3.1. 链霉菌发酵培养和代谢产物提取 | 第71页 |
| 3.2. 天然产物分离纯化方法 | 第71-72页 |
| 3.3. 化合物的结构测定 | 第72页 |
| 4. 实验结果 | 第72-78页 |
| 4.1. 发酵培养和提取代谢产物 | 第72-73页 |
| 4.2. 提取物分离纯化 | 第73-77页 |
| 4.3. 分析讨论 | 第77-78页 |
| 第七节 小结 | 第78-80页 |
| 第三章 链霉菌Streptomyces sp.LZ35菌株的两个倍半萜合酶基因的克隆和异源表达 | 第80-93页 |
| 前言 | 第80页 |
| 第一节 倍半萜合酶基因pen的克隆、异源表达和结晶 | 第80-86页 |
| 1. 实验材料 | 第80-81页 |
| 1.1. 质粒和菌株 | 第80-81页 |
| 1.2. 引物 | 第81页 |
| 1.3. 试剂 | 第81页 |
| 1.4. 仪器 | 第81页 |
| 1.5. 培养基 | 第81页 |
| 2. 方法 | 第81页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第81-86页 |
| 3.1. pentalene synthase表达体系的构建 | 第81-82页 |
| 3.2. pentalene synthase的蛋白表达和纯化 | 第82-85页 |
| 3.3. pentalene synthase结晶 | 第85-86页 |
| 第二节 倍半萜合酶基因geo的克隆和异源表达 | 第86-92页 |
| 1. 实验材料 | 第86-87页 |
| 1.1. 质粒和菌株 | 第86页 |
| 1.2. 引物 | 第86页 |
| 1.3. 试剂 | 第86页 |
| 1.4. 仪器 | 第86页 |
| 1.5. 培养基 | 第86-87页 |
| 2. 方法 | 第87页 |
| 3. 实验结果与讨论 | 第87-92页 |
| 3.1. geosmin synthase表达体系的构建 | 第87-88页 |
| 3.2. geosmin synthase的蛋白表达 | 第88-91页 |
| 3.3. 讨论 | 第91-92页 |
| 第三节 小结 | 第92-93页 |
| 第四章 总结与展望 | 第93-96页 |
| 一、本论文研究的意义 | 第93页 |
| 二、本论文的主要研究 | 第93-96页 |
| 1. 二萜合酶基因cyclooctatin synthase gene cyc的研究 | 第93-94页 |
| 2. 两个倍半萜合酶基因的克隆和异源表达 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-106页 |
| 研究生期间发表论文 | 第106-107页 |
| 致谢 | 第107-109页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第109页 |
