| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 溶瘤腺病毒介导的miR-34a 协同IL-24 对肝癌的治疗 | 第15-44页 |
| 1 前言 | 第15-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-33页 |
| 2.1 材料 | 第19-22页 |
| 2.1.1 生化试剂 | 第19页 |
| 2.1.2 培养基及细胞培养液 | 第19页 |
| 2.1.3 菌株质粒 | 第19页 |
| 2.1.4 细胞株系及培养条件 | 第19页 |
| 2.1.5 引物的设计与合成 | 第19-20页 |
| 2.1.6 裸鼠来源及培养 | 第20-21页 |
| 2.1.7 主要仪器与设备 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-33页 |
| 2.2.1 miR-34a 及IL-24 基因的克隆 | 第22-23页 |
| 2.2.1.1 miR-34a 基因的克隆 | 第22页 |
| 2.2.1.2 IL-24 基因的克隆 | 第22-23页 |
| 2.2.2 三种不同单一pol II 启动子调控的miR-34a 和蛋白共表达载体穿梭质粒的制备 | 第23页 |
| 2.2.2.1 穿梭质粒pShuttle-cmv-miR-34a 的制备 | 第23页 |
| 2.2.2.2 穿梭质粒204-miR-34a 的制备 | 第23页 |
| 2.2.2.3 穿梭质粒204-IL-24-miR-34a 的制备 | 第23页 |
| 2.2.3 重组腺病毒载体质粒的构建 | 第23-24页 |
| 2.2.4 质粒DNA 的制备 | 第24-26页 |
| 2.2.4.1 质粒DNA 的小量制备 | 第24-25页 |
| 2.2.4.2 质粒DNA 大量提取 | 第25-26页 |
| 2.2.5 酶切与连接 | 第26页 |
| 2.2.5.1 线状质粒DNA 的去磷酸化 | 第26页 |
| 2.2.5.2 DNA 片段和载体的连接 | 第26页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第26-27页 |
| 2.2.6.1 氯化钙法 | 第26-27页 |
| 2.2.6.2 电转法 | 第27页 |
| 2.2.7 腺病毒的构建、鉴定与大量制备 | 第27-30页 |
| 2.2.7.1 腺病毒的构建与鉴定 | 第27-28页 |
| 2.2.7.2 病毒大量制备和CsCl 梯度离心纯化 | 第28-29页 |
| 2.2.7.3 病毒滴度测定 | 第29-30页 |
| 2.2.8 Western blot | 第30-31页 |
| 2.2.8.1 抽提样品 | 第30页 |
| 2.2.8.2 样品总蛋白浓度测定 | 第30页 |
| 2.2.8.3 SDS-PAGE | 第30页 |
| 2.2.8.4 转膜 | 第30-31页 |
| 2.2.8.5 杂交及检测 | 第31页 |
| 2.2.9 MTT 检测细胞的存活 | 第31页 |
| 2.2.10 动物试验 | 第31-32页 |
| 2.2.11 qRT-PCR 检测microRNA 表达 | 第32-33页 |
| 2.2.11.1 总RNA 提取 | 第32页 |
| 2.2.11.2 逆转录 | 第32页 |
| 2.2.11.3 荧光定量 | 第32-33页 |
| 3 实验结果 | 第33-40页 |
| 3.1 构建出单一pol II 启动子调控的microRNA 载体及microRNA 和蛋白共表达载体穿梭质粒 | 第33-35页 |
| 3.2 在BJ5183 菌株中通过同源重组得到腺病毒质粒 | 第35页 |
| 3.2.1 Ad-miR-34a 的重组 | 第35页 |
| 3.2.2 AdCN205-miR-34 及AdCN205-IL-24-miR-34a 的重组 | 第35页 |
| 3.3 包装并扩增出正确且高滴度的重组腺病毒 | 第35-36页 |
| 3.4 病毒AdCN205-IL-24-miR-34a，AdCN205-miR-34a 以及Ad-miR-34a 均可表达成熟体miR-34a | 第36-37页 |
| 3.5 病毒AdCN205-IL-24-miR-34a 可表达IL-24 蛋白 | 第37页 |
| 3.6 病毒AdCN205-IL-24-miR-34a 以及AdCN205-miR-34a 可以抑制Bcl-2 和SIRT1的表达 | 第37-38页 |
| 3.7 病毒对肿瘤细胞及正常细胞的杀伤检测 | 第38-39页 |
| 3.8 病毒AdCN205-IL-24-miR-34a 以及AdCN205-miR-34a 可以抑制小鼠移植瘤生长并使肿瘤消退 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40-44页 |
| 第二章 文献综述 | 第44-55页 |
| 1 MIR-34 家族的生物学特征 | 第44-48页 |
| 2 MIR-34 家族生物学功能及分子机制 | 第48-51页 |
| 2.1 miR-34 家族的生物学功能 | 第48页 |
| 2.2 miR-345 直接受p53 调节 | 第48-49页 |
| 2.3 miR-345 参与p53 调控网络的功能 | 第49-50页 |
| 2.4 miR-345 对p53 具有正反馈调节作用 | 第50-51页 |
| 3 MIR-34 家族与恶性肿瘤的关系 | 第51-53页 |
| 3.1 MIR-345 与结肠癌 | 第51-52页 |
| 3.2 MIR-345 与肝癌 | 第52页 |
| 3.3 MIR-345 与其他恶性肿瘤 | 第52-53页 |
| 4 MIR-34 家族在治疗中的应用及展望 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 硕士阶段发表论文(第一作者) | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
