| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 综述 | 第10-25页 |
| 1.1 里氏木霉RUT-C30菌株的研究概况 | 第10-16页 |
| 1.1.1 里氏木霉与其突变株RUT-C30的起源 | 第10页 |
| 1.1.2 里氏木霉的突变改造伊始 | 第10-11页 |
| 1.1.3 RUT-C30细胞结构的改变 | 第11页 |
| 1.1.4 对于里氏木霉RUT-C30基因变化的研究 | 第11-12页 |
| 1.1.5 里氏木霉RUT-C30基因表达转录组学的研究 | 第12-13页 |
| 1.1.6 里氏木霉RUT-C30基因组中序列变化的研究 | 第13-14页 |
| 1.1.7 里氏木霉RUT-C30作为宿主菌用于表达异源蛋白的近况 | 第14-15页 |
| 1.1.8 现有对里氏木霉研究的成果 | 第15-16页 |
| 1.2 里氏木霉中的蛋白酶及蛋白酶的应用 | 第16-21页 |
| 1.2.1 里氏木霉中蛋白酶对表达蛋白产物的影响 | 第16-17页 |
| 1.2.2 蛋白酶的分类 | 第17-18页 |
| 1.2.3 蛋白酶的应用 | 第18-21页 |
| 1.3 里氏木霉中的基因改造手段 | 第21-24页 |
| 1.3.1 原生质体转化 | 第21页 |
| 1.3.2 农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium-mediated transformation,AMT) | 第21-24页 |
| 1.4 本文主要研究内容 | 第24-25页 |
| 第2章 材料与方法 | 第25-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-32页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第25页 |
| 2.1.2 培养基配方 | 第25-29页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.4 引物序列 | 第30-31页 |
| 2.1.5 实验主要仪器 | 第31-32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-41页 |
| 2.3 实验过程中使用的生物学软件 | 第41-42页 |
| 第3章 里氏木霉通用质粒构建与筛选标记改造及添加 | 第42-49页 |
| 3.1 里氏木霉基因改造通用质粒的构建 | 第42-43页 |
| 3.1.1 质粒的构建思路 | 第42页 |
| 3.1.2 质粒的构建方法 | 第42页 |
| 3.1.3 ppk1通用质粒的使用 | 第42-43页 |
| 3.2 里氏木霉中筛选标记的改造与添加 | 第43-48页 |
| 3.2.1 潮霉素抗性基因的问题 | 第43页 |
| 3.2.2 潮霉素磷酸转移酶B的截短改造 | 第43-45页 |
| 3.2.3 潮霉素磷酸转移酶B的截短效果 | 第45页 |
| 3.2.4 G418抗性基因的引入尝试 | 第45页 |
| 3.2.5 G418抗性基因的实验结果 | 第45-46页 |
| 3.2.6 amdS营养缺陷型筛选标记的引入 | 第46页 |
| 3.2.7 amdS营养缺陷型筛选标记的效果 | 第46-48页 |
| 3.3 本章小结 | 第48-49页 |
| 第4章 里氏木霉丝氨酸蛋白酶的验证及敲除 | 第49-60页 |
| 4.1 里氏木霉中蛋白酶的确定 | 第49-54页 |
| 4.1.1 确认里氏木霉中各类蛋白酶基因的存在 | 第49-51页 |
| 4.1.2 里氏木霉RUT-C30蛋白酶基因的RT-PCR | 第51-53页 |
| 4.1.3 里氏木霉RUT-C30胞外发酵液蛋白酶活测定 | 第53-54页 |
| 4.1.4 里氏木霉RUT-C30蛋白酶的确定 | 第54页 |
| 4.2 里氏木霉中丝氨酸蛋白酶的敲除 | 第54-59页 |
| 4.2.1 基因敲除质粒pSB003的构建 | 第54-55页 |
| 4.2.2 里氏木霉中丝氨酸蛋白酶的敲除及阳性验证 | 第55-57页 |
| 4.2.3 里氏木霉中丝氨酸蛋白酶敲除的效果验证 | 第57-59页 |
| 4.3 本章小结 | 第59-60页 |
| 第5章 丝氨酸蛋白酶的异源表达 | 第60-63页 |
| 5.1 丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中的表达 | 第60-61页 |
| 5.1.1 构建大肠杆菌异源表达质粒 | 第60页 |
| 5.1.2 在大肠杆菌BL21菌株中表达丝氨酸蛋白酶 | 第60-61页 |
| 5.1.3 在大肠杆菌Rosetta菌株中表达丝氨酸蛋白酶 | 第61页 |
| 5.2 丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母的表达 | 第61-62页 |
| 5.2.1 构建毕赤酵母异源表达质粒 | 第61页 |
| 5.2.2 丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达 | 第61-62页 |
| 5.3 本章小结 | 第62-63页 |
| 第6章 结论与展望 | 第63-64页 |
| 6.1 结论 | 第63页 |
| 6.2 展望 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
