| 中文摘要 | 第8-10页 |
| 英文摘要 | 第10-11页 |
| 英文缩写 | 第12-13页 |
| 第一部分 密码子优化的人生长素基因在大肠杆菌中表达的研究 | 第13-39页 |
| 重组人生长素的研究进展及应用前景 | 第13-17页 |
| 1 人生长激素的结构与性质 | 第13页 |
| 2 人生长激素的功能及应用 | 第13-14页 |
| 3 人生长激素的基因工程表达 | 第14-17页 |
| 密码子偏爱性与外源蛋白的表达 | 第17-22页 |
| 1 密码子的偏爱性 | 第17-18页 |
| 2 密码子的优化 | 第18-20页 |
| 2.1 密码子替换 | 第18-20页 |
| 2.1.1 起始密码子周边序列的优化 | 第18-19页 |
| 2.1.2 基因编码区的优化 | 第19-20页 |
| 2.1.3 终止密码子周边序列的优化 | 第20页 |
| 3. 修饰宿主提高表达 | 第20-22页 |
| 论文正文 密码子优化的人生长素基因在大肠杆菌中表达的研究 | 第22-39页 |
| 1 材料与方法 | 第23-28页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第23页 |
| 1.2 工具酶及主要试剂 | 第23页 |
| 1.3 其它试剂 | 第23-24页 |
| 1.4 主要实验仪器 | 第24页 |
| 1.5 质粒提取所需韵试剂 | 第24页 |
| 1.6 SDS-PAGE电泳所需的主要试剂 | 第24-25页 |
| 1.7 LB培养基 | 第25页 |
| 1.8 方法 | 第25-28页 |
| 1.8.1 基因设计 | 第25页 |
| 1.8.2 寡核昔酸片断的合成 | 第25-26页 |
| 1.8.3 目的基因的 PCR扩增 | 第26-27页 |
| 1.8.4 扩增片断的克隆及序列分析 | 第27页 |
| 1.8.5 pET-hGH*表达载体的构建 | 第27页 |
| 1.8.6 重组菌株的筛选及诱导表达 | 第27页 |
| 1.8.7 周质蛋白的提取 | 第27页 |
| 1.8.8 SDS-PAGE和放射免疫鉴定 | 第27-28页 |
| 2 结果 | 第28-36页 |
| 2.1 优化的hGH基因序列 | 第28-29页 |
| 2.2 hGH序列的全基因拼接 | 第29-30页 |
| 2.3 表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.1 表达载体的构建如下图所示 | 第31页 |
| 2.3.2 表达载体的鉴定 | 第31页 |
| 2.4 重组质粒的诱导表达 | 第31-32页 |
| 2.5 质粒的稳定性检测 | 第32页 |
| 2.6 目的基因在pINIII-ompA3载体中的表达 | 第32-35页 |
| 2.6.1 pET-hGH(天然)重组表达质粒的诱导表达 | 第33页 |
| 2.6.2 pSS-hGH重组质粒的表达 | 第33页 |
| 2.6.3 pINIII-ompA-hGH*表达载体的构建及表达 | 第33-35页 |
| 2.6.3.1 pINIII-ompA-hGH*表达载体的构建 | 第34页 |
| 2.6.3.2 pINIII-ompA-hGH*表达载体的表达 | 第34-35页 |
| 2.7 表达产物的免疫学鉴定 | 第35-36页 |
| 3 讨论 | 第36-39页 |
| 第二部分 人生长素基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第39-60页 |
| 巴氏毕赤酵母表达外源基因的研究进展 | 第39-46页 |
| 1 宿主 | 第39-40页 |
| 2 表达载体 | 第40-42页 |
| 3 外源蛋白表达的优化策略 | 第42-44页 |
| 4 展望 | 第44-46页 |
| 论文正文 人生长素基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第46-60页 |
| 1 材料与方法 | 第47-51页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第47页 |
| 1.2 工具酶及主要试剂 | 第47页 |
| 1.3 主要仪器 | 第47页 |
| 1.4 主要培养基 | 第47-48页 |
| 1.5 其他试剂及仪器同第一部分材料 | 第48页 |
| 1.6 方法 | 第48-51页 |
| 1.6.1 目的基因片断的扩增 | 第49页 |
| 1.6.2 PCR产物3’末端加 A | 第49页 |
| 1.6.3 PCR产物的 T克隆 | 第49页 |
| 1.6.4 XL-1-Blue感受态细菌的转化 | 第49页 |
| 1.6.5 质粒的抽提及鉴定 | 第49页 |
| 1.6.6 重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| 1.6.7 表达质粒转化酵母宿主菌 | 第50页 |
| 1.6.8 G418筛选整合有多拷贝子hGH基因的克隆 | 第50页 |
| 1.6.9 阳性菌落的筛选 | 第50页 |
| 1.6.10 酵母染色体中整合hGH基因的 PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 1.6.11 表达菌株的诱导表达 | 第51页 |
| 1.6.12 酵母表达的人生长素的鉴定 | 第51页 |
| 2 结果 | 第51-56页 |
| 2.1 表达质粒的构建与鉴定 | 第51-52页 |
| 2.2 多拷贝整合转化子的筛选及 PCR检测 | 第52-53页 |
| 2.3 重组蛋白的表达 | 第53页 |
| 2.4 表达产物的免疫学鉴定 | 第53-54页 |
| 2.5 保护剂对蛋白表达的影响 | 第54页 |
| 2.6 拷贝数对蛋白表达水平的影响 | 第54-55页 |
| 2.7 rhGH在发酵过程中的pH值变化 | 第55-56页 |
| 3 讨论 | 第56-60页 |
| 3.1 基因表达系统的选择 | 第56页 |
| 3.2 信号肽的选择及其识别位点的设计 | 第56-57页 |
| 3.3 毕赤酵母基因组 DNA的制备方法 | 第57页 |
| 3.4 毕赤酵母的转化 | 第57页 |
| 3.5 多拷贝转化子的筛选 | 第57-58页 |
| 3.6 密码子的使用 | 第58页 |
| 3.7 摇瓶水平上对表达条件初步摸索 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 附录 | 第65-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
