| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-16页 |
| 1. 角蛋白酶的种类及其来源 | 第10-11页 |
| 2. 角蛋白酶的理化性质 | 第11页 |
| 3. 角蛋白酶的降解机理 | 第11-12页 |
| 4. 角蛋白酶的蛋白质工程的研究进展 | 第12-15页 |
| 4.1. 酶的改性策略 | 第12-13页 |
| 4.2 酶的体外定向进化 | 第13页 |
| 4.3 构建基因多样性的突变体库 | 第13-14页 |
| 4.4 高通量筛选方法 | 第14-15页 |
| 5. 本研究的前期工作基础及目的意义 | 第15-16页 |
| 5.1 与题目有关的研究工作积累 | 第15页 |
| 5.2 本研究的目的意义 | 第15-16页 |
| 第二章 易错PCR技术提高枯草芽孢杆菌角蛋白酶活性研究 | 第16-45页 |
| 1 材料 | 第16-19页 |
| 1.1 主要载体及菌株 | 第16-17页 |
| 1.2 主要试剂 | 第17页 |
| 1.3 主要缓冲液 | 第17-18页 |
| 1.4 主要培养基 | 第18-19页 |
| 1.5 主要仪器 | 第19页 |
| 2 实验方法 | 第19-28页 |
| 2.1 构建角蛋白酶基因突变体库 | 第19-24页 |
| 2.1.1 突变角蛋白酶基因的获得 | 第19-20页 |
| 2.1.1.1 易错PCR模板的获得 | 第19页 |
| 2.1.1.2 易错PCR | 第19页 |
| 2.1.1.3 易错PCR体系 | 第19-20页 |
| 2.1.1.4 突变的获得 | 第20页 |
| 2.1.2 突变角蛋白酶基因pPICZαA表达载体的构建 | 第20-23页 |
| 2.1.2.1 表达载体准备 | 第20-21页 |
| 2.1.2.2 易错PCR产物、pPICZαA质粒的双酶切处理 | 第21页 |
| 2.1.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第21-22页 |
| 2.1.2.4 酶切回收的KerCep与pPICZαA表达载体的连接 | 第22页 |
| 2.1.2.5 连接产物转化入大肠杆菌,筛选阳性转化子 | 第22-23页 |
| 2.1.3 重组表达载体pPICZαA-kerC~(ep)的电击转化及转化子的筛选 | 第23-24页 |
| 2.1.3.1 重组表达载体的线性化 | 第23页 |
| 2.1.3.2 毕赤巴斯德酵母X-33感受态制备 | 第23-24页 |
| 2.1.3.3 电击转化 | 第24页 |
| 2.1.3.4 重组转化子的检测 | 第24页 |
| 2.2 角蛋白酶突变体库的高通量筛选 | 第24-26页 |
| 2.2.1 阳性转化子高通量筛选 | 第24-25页 |
| 2.2.2 角蛋白酶的活力测定 | 第25-26页 |
| 2.3 突变株的遗传稳定性分析 | 第26页 |
| 2.4 突变角蛋白酶的分离纯化及酶学性质分析 | 第26-27页 |
| 2.4.1 突变角蛋白酶基因在毕赤巴斯德酵母中的表达产物的分离纯化 | 第26页 |
| 2.4.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第26页 |
| 2.4.3 突变角蛋白酶的酶学性质研究 | 第26-27页 |
| 2.4.3.1 最适反应温度的测定 | 第26页 |
| 2.4.3.2 最适反应pH的测定 | 第26-27页 |
| 2.4.3.3 热稳定性的测定 | 第27页 |
| 2.4.3.4 不同金属离子对酶活的影响 | 第27页 |
| 2.5 突变角蛋白酶基因序列及结构分析 | 第27-28页 |
| 2.5.1 突变角蛋白基因序列测定 | 第27页 |
| 2.5.2 突变角蛋白酶二级结构预测 | 第27页 |
| 2.5.3 突变角蛋白酶三级结构预测 | 第27-28页 |
| 3 结果 | 第28-42页 |
| 3.1 构建角蛋白酶基因突变体库 | 第28-31页 |
| 3.1.1 突变角蛋白酶基因的获得 | 第28-29页 |
| 3.1.2 突变角蛋白酶基因pPICZaA表达载体的构建 | 第29-30页 |
| 3.1.3 易错重组质粒的电击转化及阳性转化子的筛选 | 第30-31页 |
| 3.2 角蛋白酶基因突变体库的高通量筛选 | 第31-32页 |
| 3.3 重组菌株的遗传稳定性分析 | 第32页 |
| 3.4 突变角蛋白酶的纯化及酶学性质分析 | 第32-35页 |
| 3.4.1 突变的角蛋白酶的分离纯化和SDS-PAGE分析 | 第32-33页 |
| 3.4.2 突变角蛋白酶的酶学性质分析 | 第33-35页 |
| 3.4.2.1 最适反应温度的测定 | 第33页 |
| 3.4.2.2 最适反应pH的测定 | 第33-34页 |
| 3.4.2.3 热稳定性的测定 | 第34页 |
| 3.4.2.4 金属离子对重组角蛋白酶的影响 | 第34-35页 |
| 3.5 突变角蛋白酶基因序列及结构分析 | 第35-42页 |
| 3.5.1 突变角蛋白酶序列的测定 | 第35-38页 |
| 3.5.2 突变角蛋白酶二级结构预测 | 第38-39页 |
| 3.5.3 突变角蛋白酶三维结构的预测分析 | 第39-42页 |
| 4 讨论 | 第42-45页 |
| 4.1 定向改造易错的条件 | 第42页 |
| 4.2 突变体文库及高通量筛选 | 第42-43页 |
| 4.3 突变角蛋白酶的酶学性质 | 第43页 |
| 4.4 突变角蛋白酶的结构分析 | 第43-45页 |
| 结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-50页 |
| 致谢 | 第50页 |
