| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第10-20页 |
| 1.1 克雷伯氏肺炎杆菌 | 第10页 |
| 1.2 克雷伯氏肺炎杆菌的工业应用 | 第10-12页 |
| 1.2.1 利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产1,3-丙二醇 | 第10-11页 |
| 1.2.2 利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产2,3-丁二醇 | 第11-12页 |
| 1.2.3 利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产3-羟基丙酸 | 第12页 |
| 1.3 克雷伯氏肺炎杆菌的代谢工程改造 | 第12-13页 |
| 1.3.1 克雷伯氏肺炎杆菌中基因敲除的研究 | 第12-13页 |
| 1.3.2 克雷伯氏肺炎杆菌中目的基因强化表达的研究 | 第13页 |
| 1.4 同源重组技术的应用 | 第13-16页 |
| 1.4.1 同源重组技术 | 第13页 |
| 1.4.2 同源重组技术的关键蛋白 | 第13-14页 |
| 1.4.3 同源重组技术应用于基因敲除 | 第14-15页 |
| 1.4.4 同源重组技术应用于基因组整合 | 第15-16页 |
| 1.5 不同启动子分析比较的研究 | 第16-17页 |
| 1.6 常用的报告基因 | 第17-18页 |
| 1.6.1 荧光素酶基因 | 第17页 |
| 1.6.2 碱性磷酸酶基因 | 第17-18页 |
| 1.6.3 绿色荧光蛋白基因 | 第18页 |
| 1.6.4 β-半乳糖苷酶基因 | 第18页 |
| 1.7 本课题研究内容及意义 | 第18-20页 |
| 第2章 材料与方法 | 第20-34页 |
| 2.1 材料 | 第20-25页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第20-21页 |
| 2.1.2 引物 | 第21-22页 |
| 2.1.3 限制性内切酶、Marker等分子生物学试剂 | 第22页 |
| 2.1.4 主要化学试剂 | 第22-24页 |
| 2.1.5 培养基配方及抗生素浓度 | 第24页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.7 应用软件及程序 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-34页 |
| 2.2.1 微生物培养 | 第25页 |
| 2.2.2 菌株保藏 | 第25页 |
| 2.2.3 K. pneumoniae基因组的抽提 | 第25-26页 |
| 2.2.4 PCR扩增目的片段 | 第26-27页 |
| 2.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
| 2.2.6 PCR产物的纯化与回收 | 第27-28页 |
| 2.2.7 质粒抽提 | 第28-29页 |
| 2.2.8 DNA的双酶切 | 第29页 |
| 2.2.9 DNA片段的连接 | 第29页 |
| 2.2.10 大肠杆菌DH5α感受态的制备 | 第29-30页 |
| 2.2.11 热激法转化操作 | 第30页 |
| 2.2.12 K.pneumoniae感受态的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.13 K.pneumoniae电转化操作 | 第31页 |
| 2.2.14 电转杯的处理方法 | 第31-32页 |
| 2.2.15 阳性克隆的筛选方法 | 第32页 |
| 2.2.16 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第32页 |
| 2.2.17 β-半乳糖苷酶的酶活测定 | 第32-33页 |
| 2.2.18 发酵实验方法 | 第33页 |
| 2.2.19 产物分析NAD与NADH的测定 | 第33-34页 |
| 第3章 利用Red重组系统将目的基因整合于基因组中进行表达 | 第34-48页 |
| 3.1 前言 | 第34页 |
| 3.2 Red同源重组系统应用于目的基因的实验设计 | 第34-36页 |
| 3.2.1 打靶片段的设计 | 第34-35页 |
| 3.2.2 替换基因(敲除基因)的选择 | 第35-36页 |
| 3.2.3 目的基因的选择 | 第36页 |
| 3.3 用于基因组整合的打靶片段的构建 | 第36-41页 |
| 3.3.1 K. pneumoniae基因组抽提 | 第36-37页 |
| 3.3.2 pETbud::dhaT质粒构建 | 第37页 |
| 3.3.3 打靶片段构建 | 第37-40页 |
| 3.3.4 三步PCR法获得打靶片段 | 第40-41页 |
| 3.4 利用Red重组技术进行基因整合 | 第41-44页 |
| 3.4.1 pKD46-Tc质粒导入K.pneumoniae KG2菌株 | 第41-42页 |
| 3.4.2 打靶片段的电转 | 第42-43页 |
| 3.4.3 抗性基因的移除 | 第43-44页 |
| 3.5 整合dhaT基因后克雷伯氏肺炎杆菌KG3-2特性鉴定 | 第44-45页 |
| 3.6 讨论 | 第45-47页 |
| 3.7 本章小结 | 第47-48页 |
| 第4章 不同启动子在克雷伯氏肺炎杆菌中的表达分析 | 第48-61页 |
| 4.1 前言 | 第48页 |
| 4.2 不同启动子表达载体的构建 | 第48-53页 |
| 4.2.1 lacZ基因的扩增 | 第48-49页 |
| 4.2.2 pETbud::lacZ和pETtac::lacZ构建 | 第49-51页 |
| 4.2.3 pETT5::lacZ构建 | 第51-53页 |
| 4.3 不同启动子在LB培养基中的分析 | 第53-57页 |
| 4.3.1 启动子的选择 | 第53页 |
| 4.3.2 不同启动子在克雷伯氏肺炎杆菌中强弱的定量分析 | 第53-55页 |
| 4.3.3 培养过程中启动子在克雷伯氏肺炎杆菌的稳定性 | 第55-57页 |
| 4.4 不同启动子在不同碳源培养基中的分析 | 第57-58页 |
| 4.5 讨论 | 第58-60页 |
| 4.6 本章小结 | 第60-61页 |
| 第5章 总结与展望 | 第61-63页 |
| 5.1 结论 | 第61页 |
| 5.2 展望 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
