| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 名词缩写 | 第14-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-30页 |
| 1.1 研究背景与意义 | 第16-17页 |
| 1.2 研究现状 | 第17-26页 |
| 1.2.1 肝素、肝素修饰酶与肝素的合成 | 第17-22页 |
| 1.2.2 低分子量肝素、肝素裂解酶与肝素的降解 | 第22-25页 |
| 1.2.3 构效关系 | 第25-26页 |
| 1.3 研究路线 | 第26-30页 |
| 1.3.1 肝素体外酶法合成 | 第26-28页 |
| 1.3.2 酶膜反应器降解低分子量肝素 | 第28-29页 |
| 1.3.3 稳定性与构效关系 | 第29-30页 |
| 第二章 动物肝素的结构鉴定与体外生物活性研究 | 第30-41页 |
| 2.1 概述 | 第30页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第30-34页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第30-31页 |
| 2.2.2 动物肝素分子量分析 | 第31页 |
| 2.2.3 核磁共振(NMR)分析 | 第31-32页 |
| 2.2.4 肝素二糖与四糖制备 | 第32页 |
| 2.2.5 二糖与四糖组成液质联用分析 | 第32-33页 |
| 2.2.6 亲水反应色谱与电喷雾傅里叶变换质谱联用(HILIC LC-ESI-FT-MS)分析 | 第33页 |
| 2.2.7 肝素生物芯片制备 | 第33页 |
| 2.2.8 表面等离子共振(SPR)生物活性分析 | 第33-34页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第34-40页 |
| 2.3.1 凝胶排阻色谱(SEC)分析 | 第34页 |
| 2.3.2 一维与二维核磁共振结构鉴定 | 第34-37页 |
| 2.3.3 二糖与四糖组成液质联用(LC-MS)分析 | 第37-38页 |
| 2.3.4 HILIC LC-ESI-FT-MS分析 | 第38-40页 |
| 2.3.5 SPR生物活性分析 | 第40页 |
| 2.4 本章小结与讨论 | 第40-41页 |
| 第三章 生物工程肝素的制备、结构鉴定和体外抗凝血性研究 | 第41-70页 |
| 3.1 概述 | 第41页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第41-47页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第41-42页 |
| 3.2.2 肝素前体heparosan发酵制备与纯化 | 第42页 |
| 3.2.3 N-sulfo,N-acetyl h-arosan(NSNAH)的化学法制备 | 第42-43页 |
| 3.2.4 甲醇沉淀法纯化硫酸化修饰产物 | 第43页 |
| 3.2.5 酶法C5异构化与2-O-硫酸化 | 第43页 |
| 3.2.6 酶法6-O-硫酸化催化 | 第43-44页 |
| 3.2.7 酶法3-O-硫酸化 | 第44页 |
| 3.2.8 强效阴离子交换(SAX)色谱法纯化 | 第44页 |
| 3.2.9 Micro-Carbazole糖含量分析 | 第44页 |
| 3.2.10 二糖、四糖制备与组成分析 | 第44-45页 |
| 3.2.11 核磁共振结构分析 | 第45页 |
| 3.2.12 体外Anti-Xa与Anti-Ha抗凝血活性分析 | 第45页 |
| 3.2.13 全氘代肝素的制备与纯化 | 第45-46页 |
| 3.2.14 全氘代肝素各步硫酸化产物二糖的2-aminoacridone(AMAC)标记 | 第46页 |
| 3.2.15 AMAC标记二糖LC-MS分析 | 第46-47页 |
| 3.2.16 核磁共振一维氘(~2H)谱分析 | 第47页 |
| 3.2.17 核磁共振一维碳谱分析 | 第47页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第47-68页 |
| 3.3.1 肝素前体heparosan的纯度分析与结构鉴定 | 第47-49页 |
| 3.3.2 NSNAH纯度分析与结构鉴定 | 第49-51页 |
| 3.3.3 NSNA2SHp的二糖组成LC-MS分析 | 第51-52页 |
| 3.3.4 NSNA2SHp的核磁共振分析 | 第52-54页 |
| 3.3.5 NSNA2S6SHp的二糖组成LC-MS分析 | 第54-55页 |
| 3.3.6 3-O-硫酸化产物的二糖与四糖组成分析 | 第55-56页 |
| 3.3.7 Micro-Carbazole糖含量分析 | 第56-57页 |
| 3.3.8 SAX0.8 M与1.0M组分(生物工程抗凝血肝素)的二糖与四糖组成LC-MS分析 | 第57-59页 |
| 3.3.9 生物工程抗凝血肝素的核磁共振分析 | 第59-61页 |
| 3.3.10 生物工程抗凝血肝素体外抗凝血活性分析 | 第61-62页 |
| 3.3.11 全氘代肝素(D-heparin)及各步硫酸化修饰中间体化学结构鉴定 | 第62-68页 |
| 3.4 本章小结与讨论 | 第68-70页 |
| 第四章 酶膜反应制备新型低分子肝素及其结构与生物活性活性鉴定 | 第70-86页 |
| 4.1 概述 | 第70页 |
| 4.2 实验步骤 | 第70-74页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第70页 |
| 4.2.2 肝素寡糖膜分离特性研究 | 第70-71页 |
| 4.2.3 Heparin lyase缓冲液交换与酶活性检测 | 第71页 |
| 4.2.4 酶膜反应器降解制备低分子量肝素 | 第71-72页 |
| 4.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第72页 |
| 4.2.6 凝胶排阻色谱分析 | 第72-73页 |
| 4.2.7 核磁共振分析 | 第73页 |
| 4.2.8 二糖与四糖组成LC-MS分析 | 第73页 |
| 4.2.9 SPR分析低分子量肝素ATⅢ和PF4结合活性 | 第73页 |
| 4.2.10 体外Anti-Xa与Anti-Ⅱa活性分析 | 第73-74页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第74-85页 |
| 4.3.1 肝素寡糖膜分离特性分析 | 第74-75页 |
| 4.3.2 Heparin lyase活性分析 | 第75页 |
| 4.3.3 酶膜反应制备的低分子量肝素回收率与分子量分析 | 第75-77页 |
| 4.3.4 一维、二维核磁共振分析 | 第77-80页 |
| 4.3.5 二糖与四糖组成LC-MS分析 | 第80-82页 |
| 4.3.6 表面等离子共振分析 | 第82-83页 |
| 4.3.7 体外Anti-Xa和Anti-Ⅱa抗凝血活性分析 | 第83-85页 |
| 4.4 本章小结与讨论 | 第85-86页 |
| 第五章 肝素中胺类物质的氘代乙酰化HILIC-MS检测法与构效关系研究 | 第86-96页 |
| 5.1 概述 | 第86页 |
| 5.2 实验材料和方法 | 第86-88页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第86页 |
| 5.2.2 肝素热处理和高压热灭菌 | 第86-87页 |
| 5.2.3 氘代乙酰衍生化 | 第87页 |
| 5.2.4 核磁共振分析 | 第87页 |
| 5.2.5 肝素二糖与氘代乙酰二糖制备 | 第87页 |
| 5.2.6 HILIC LC ESI-LTQ-Orbitrap-FT-MS分析 | 第87-88页 |
| 5.2.7 表面等离子共振分析 | 第88页 |
| 5.3 实验结果与分析 | 第88-95页 |
| 5.3.1 核磁共振分析 | 第88-90页 |
| 5.3.2 HILIC LC ESI-LTQ-Orbitrap-FT-MS分析 | 第90-94页 |
| 5.3.3 表面等离子共振分析 | 第94-95页 |
| 5.4 本章小结 | 第95-96页 |
| 全文总结 | 第96-98页 |
| 展望 | 第98-100页 |
| 参考文献 | 第100-105页 |
| 附图 | 第105-172页 |
| 致谢 | 第172-174页 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 | 第174-175页 |
