| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-30页 |
| 1 弧菌及其毒力因子研究进展 | 第13-24页 |
| 1.1 副溶血弧菌 | 第13-17页 |
| 1.1.1 溶血素 | 第14-15页 |
| 1.1.2 Ⅲ型分泌系统(T3SS) | 第15-16页 |
| 1.1.3 尿素酶(urease) | 第16页 |
| 1.1.4 黏附因子 | 第16-17页 |
| 1.1.5 其他毒力因子 | 第17页 |
| 1.2 霍乱弧菌(Vibrio cholerae) | 第17-19页 |
| 1.2.1 霍乱毒素(CTX) | 第18页 |
| 1.2.2 毒素协同菌毛 | 第18-19页 |
| 1.2.3 凝血素 | 第19页 |
| 1.2.4 其他毒力因子 | 第19页 |
| 1.3 创伤弧菌 | 第19-21页 |
| 1.3.1 创伤弧菌溶细胞素(VVC) | 第20页 |
| 1.3.2 金属蛋白酶(VVP) | 第20-21页 |
| 1.3.3 儿茶酚亲铁物质 | 第21页 |
| 1.3.4 其他毒力因子 | 第21页 |
| 1.4 拟态弧菌 | 第21-23页 |
| 1.4.1 溶血素 | 第21-22页 |
| 1.4.2 黏附素 | 第22页 |
| 1.4.3 外毒素 | 第22-23页 |
| 1.4.4 栽铁体 | 第23页 |
| 1.5 溶藻弧菌 | 第23-24页 |
| 1.5.1 胞外产物 | 第23-24页 |
| 1.5.2 腊多糖 | 第24页 |
| 1.5.3 铁摄取调控系统 | 第24页 |
| 2 弧菌的检测方法进展 | 第24-30页 |
| 2.1 鉴别培养基检测 | 第24-25页 |
| 2.2 免疫学方法 | 第25-27页 |
| 2.2.1 酶联免疫吸附 | 第25页 |
| 2.2.2 免疫胶体金层析技术 | 第25-26页 |
| 2.2.3 蛋白质印迹法(Western Blot) | 第26页 |
| 2.2.4 免疫荧光技术 | 第26页 |
| 2.2.5 液相芯片技术 | 第26-27页 |
| 2.4 聚合酶链式反应(PCR)技术 | 第27-29页 |
| 2.4.1 常规PCR技术 | 第27-28页 |
| 2.4.2 环介导等温扩增技术(LAMP) | 第28页 |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR技术 | 第28-29页 |
| 2.5 小结 | 第29-30页 |
| 第二章 弧菌多抗的制备 | 第30-48页 |
| 1 材料 | 第30-31页 |
| 1.1 试验动物 | 第30页 |
| 1.2 主要试剂 | 第30页 |
| 1.3 主要仪器 | 第30-31页 |
| 1.4 相关溶液配制 | 第31页 |
| 2 方法 | 第31-38页 |
| 2.1 引物设计 | 第31-32页 |
| 2.2 两对引物验证 | 第32-35页 |
| 2.2.1 目的基因提取与扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.2 质粒提取 | 第33页 |
| 2.2.3 胶回收 | 第33页 |
| 2.2.4 质粒和目的基因连接 | 第33-34页 |
| 2.2.5 转化 | 第34页 |
| 2.2.6 表达蛋白 | 第34-35页 |
| 2.3 抗体制备 | 第35-37页 |
| 2.3.1 全菌抗体制备 | 第35-36页 |
| 2.3.2 蛋白表达与纯化 | 第36页 |
| 2.3.3 Western Blot鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.4 诱导蛋白抗原多抗制备 | 第37页 |
| 2.4 ELISA检测 | 第37-38页 |
| 2.5 小鼠的保护性实验 | 第38页 |
| 3 结果 | 第38-46页 |
| 3.1 目的基因扩增结果 | 第39页 |
| 3.2 质粒构建鉴定 | 第39-43页 |
| 3.2.1 菌液PCR鉴定 | 第39-40页 |
| 3.2.2 双酶切鉴定结果 | 第40-41页 |
| 3.2.3 测序比对结果 | 第41页 |
| 3.2.4 SDS-PAGE鉴定结果 | 第41-42页 |
| 3.2.5 Western Blot鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3 蛋白纯化结果 | 第43-45页 |
| 3.4 间接ELISA检测效价结果 | 第45-46页 |
| 3.4.1 方阵滴定法结果 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 免疫磁珠的构建与目的菌的捕获 | 第48-55页 |
| 1 材料 | 第48页 |
| 1.1 主要试剂 | 第48页 |
| 1.2 主要仪器 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-51页 |
| 2.1 免疫磁珠制备 | 第48-50页 |
| 2.1.1 抗体纯化 | 第48页 |
| 2.1.2 免疫磁珠活化 | 第48-49页 |
| 2.1.3 抗体与磁珠偶联 | 第49-50页 |
| 2.1.4 计算偶联率的方法 | 第50页 |
| 2.2 免疫磁珠捕获目的弧菌 | 第50-51页 |
| 2.2.1 pH对目的菌捕获的影响 | 第50页 |
| 2.2.2 捕获时间对捕获率的影响 | 第50页 |
| 2.2.3 不同浓度的目的菌对捕获率的影响 | 第50页 |
| 2.2.4 捕获率的计算方法 | 第50-51页 |
| 3 结果 | 第51-54页 |
| 3.1 磁珠偶联条件优化 | 第51-52页 |
| 3.1.1 抗体量对磁珠偶联影响的检测结果 | 第51页 |
| 3.1.2 偶联时间对磁珠偶联影响的检测结果 | 第51-52页 |
| 3.1.3 缓冲液pH值对偶联率影响的检测结果 | 第52页 |
| 3.2 免疫磁珠捕获目的菌条件优化 | 第52-54页 |
| 3.2.1 缓冲液pH对目的菌捕获影响的检测结果 | 第52-53页 |
| 3.2.2 捕获时间对目的菌捕获影响的检测结果 | 第53-54页 |
| 3.2.3 菌浓度对目的菌捕获率影响的检测结果 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 第四章 五种弧菌液相芯片技术检测方法的建立 | 第55-71页 |
| 1 材料 | 第55页 |
| 1.1 菌种 | 第55页 |
| 1.2 主要试剂 | 第55页 |
| 1.3 主要仪器 | 第55页 |
| 2 方法 | 第55-60页 |
| 2.1 引物和探针设计 | 第55-57页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第55-56页 |
| 2.1.2 特异性探针设计与合成 | 第56页 |
| 2.1.3 Blast 比对 | 第56-57页 |
| 2.2 PCR扩增 | 第57-58页 |
| 2.2.1 目的基因提取 | 第57-58页 |
| 2.2.2 PCR扩增 | 第58页 |
| 2.2.3 偶联验证 | 第58页 |
| 2.3 杂交条件优化 | 第58-59页 |
| 2.3.1 杂交温度优化 | 第58页 |
| 2.3.2 杂交时间优化 | 第58-59页 |
| 2.4 特异性实验 | 第59页 |
| 2.4.1 PCR特异性检测 | 第59页 |
| 2.4.2 液相芯片技术特异性检测 | 第59页 |
| 2.5 灵敏度检测 | 第59-60页 |
| 2.5.1 PCR灵敏度检测 | 第59页 |
| 2.5.2 液相芯片技术灵敏度检测 | 第59-60页 |
| 2.6 建立液相芯片技术多重检测方法 | 第60页 |
| 2.6.1 多重PCR检测 | 第60页 |
| 2.6.2 液相芯片技术多重检测 | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-69页 |
| 3.1 PCR扩增结果 | 第60-61页 |
| 3.2 微球偶联验证结果 | 第61-63页 |
| 3.2.1 杂交温度优化结果 | 第61-62页 |
| 3.2.2 杂交时间优化结果 | 第62-63页 |
| 3.3 特异性检测结果 | 第63-66页 |
| 3.3.1 PCR特异性检测结果 | 第63-65页 |
| 3.3.2 液相芯片技术特异性检测结果 | 第65-66页 |
| 3.4 灵敏度检测结果 | 第66-67页 |
| 3.4.1 PCR灵敏度检测结果 | 第66-67页 |
| 3.4.2 液相芯片技术灵敏度检测结果 | 第67页 |
| 3.5 多重检测方法建立验证结果 | 第67-69页 |
| 3.5.1 多重PCR结果 | 第67-68页 |
| 3.5.2 液相芯片多重检测结果 | 第68-69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 第五章 检测创伤弧菌两种毒力基因的环介导等温扩增检测方法的建立 | 第71-82页 |
| 1 材料与方法 | 第71页 |
| 1.1 材料 | 第71页 |
| 1.1.1 主要仪器和试剂 | 第71页 |
| 1.1.2 菌株 | 第71页 |
| 1.1.3 样品 | 第71页 |
| 2 方法 | 第71-75页 |
| 2.1 引物设计 | 第72-73页 |
| 2.2 DNA的提取 | 第73-74页 |
| 2.3 LAMP反应体系 | 第74页 |
| 2.4 LAMP特异性和灵敏度试验 | 第74页 |
| 2.5 PCR法检测 | 第74-75页 |
| 3 结果 | 第75-79页 |
| 3.1 LAMP反应的肉眼可视结果 | 第75页 |
| 3.2 LAMP和PCR检测创伤弧菌灵敏度的比较 | 第75-77页 |
| 3.3 LAMP检测创伤弧菌特异性试验 | 第77-78页 |
| 3.4 LAMP和PCR检测人工污染食品样品中创伤弧菌检出限比较 | 第78-79页 |
| 4 讨论 | 第79-82页 |
| 结论 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第92页 |
