| 致谢 | 第5-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文缩写词表 | 第10-18页 |
| 第一章 引言 | 第18-26页 |
| 1.1 钩端螺旋体 | 第18页 |
| 1.2 钩端螺旋体病 | 第18-19页 |
| 1.3 AAA+蛋白酶/蛋白酶体 | 第19-22页 |
| 1.3.1 真核细胞型生物蛋白酶体 | 第19-20页 |
| 1.3.2 原核细胞型微生物蛋白酶体 | 第20页 |
| 1.3.3 细菌蛋白酶体HslUV(ClpYQ) | 第20-22页 |
| 1.4 本论文研究内容与目的 | 第22-24页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第22-24页 |
| 1.4.2 研究目的 | 第24页 |
| 1.5 本论文研究方案与技术路线 | 第24-25页 |
| 1.6 本论文创新之处 | 第25-26页 |
| 第二章 问号钩体蛋白酶体基因的克隆与原核表达 | 第26-53页 |
| 2.1 前言 | 第26-27页 |
| 2.2 材料与方法 | 第27-47页 |
| 2.2.1 主要仪器、试剂及实验材料 | 第27-30页 |
| 2.2.2 主要溶液及培养基配置 | 第30-32页 |
| 2.2.3 问号钩体蛋白酶体生物信息学分析 | 第32-33页 |
| 2.2.4 问号钩体基因组DNA提取 | 第33-34页 |
| 2.2.5 问号钩体蛋白酶体基因扩增与纯化 | 第34-36页 |
| 2.2.5.1 PCR体系及条件 | 第34页 |
| 2.2.5.2 PCR扩增片段的纯化 | 第34-36页 |
| 2.2.6 问号钩体蛋白酶体基因的T-A克隆 | 第36-38页 |
| 2.2.6.1 感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 2.2.6.2 DNA片段与克隆载体的连接 | 第36页 |
| 2.2.6.3 连接产物的转化 | 第36-37页 |
| 2.2.6.4 质粒的提取 | 第37-38页 |
| 2.2.6.5 酶切鉴定与测序 | 第38页 |
| 2.2.7 问号钩体蛋白酶体基因原核表达系统的构建 | 第38-40页 |
| 2.2.7.1 各目标基因片段的获取与纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.7.2 重组质粒的构建和转化 | 第39-40页 |
| 2.2.7.3 重组质粒的提取、酶切鉴定与测序 | 第40页 |
| 2.2.8 clpA基因的克隆与表达(基于Gateway技术) | 第40页 |
| 2.2.9 重组蛋白的诱导表达 | 第40-41页 |
| 2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第41-42页 |
| 2.2.11 重组蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| 2.2.12 兔抗血清制备及Western Blot检测 | 第43-44页 |
| 2.2.13 ELISA法测定抗血清效价 | 第44-45页 |
| 2.2.14 免疫沉淀法提取钩体天然蛋白nHslU和nHslV | 第45-47页 |
| 2.3 实验结果 | 第47-52页 |
| 2.3.1 问号钩体蛋白酶体的生物信息学分析 | 第47-48页 |
| 2.3.1.1 问号钩体蛋白酶体氨基酸序列分析 | 第47页 |
| 2.3.1.2 问号钩体蛋白酶体结构预测与分析 | 第47-48页 |
| 2.3.2 问号钩体蛋白酶体基因PCR扩增结果 | 第48页 |
| 2.3.3 问号钩体蛋白酶体基因T-A克隆鉴定结果 | 第48-49页 |
| 2.3.4 问号钩体蛋白酶体基因亚克隆双酶切鉴定结果 | 第49-50页 |
| 2.3.5 ClpX/ClpP/ClpS/ClpA的重组表达和提纯结果 | 第50页 |
| 2.3.6 HslU/HslV的重组表达和提纯结果 | 第50-52页 |
| 2.3.7 问号钩体蛋白酶体各亚基的抗血清制备 | 第52页 |
| 2.4 小结 | 第52-53页 |
| 第三章 问号钩体蛋白酶体HslUV酶学性质研究 | 第53-69页 |
| 3.1 前言 | 第53-54页 |
| 3.2 材料与方法 | 第54-61页 |
| 3.2.1 主要仪器及试剂 | 第54-55页 |
| 3.2.2 主要溶液与试剂配置 | 第55-56页 |
| 3.2.3 Western Blot法检测目标蛋白 | 第56页 |
| 3.2.4 rHslUV酶活性测定 | 第56页 |
| 3.2.5 标准曲线绘制 | 第56-58页 |
| 3.2.6 酶动力学参数测定 | 第58-59页 |
| 3.2.7 rHslUV酶活性阻断实验 | 第59-60页 |
| 3.2.8 统计学分析方法 | 第60-61页 |
| 3.3 实验结果 | 第61-68页 |
| 3.3.1 问号钩体hslUV操纵子分析 | 第61页 |
| 3.3.2 问号钩体HslU/HslV功能结构域分析 | 第61-62页 |
| 3.3.3 hslU/hslV基因在不同血清群血清型问号钩体中的分布与表达情况 | 第62-63页 |
| 3.3.4 问号钩体rHslU和rHslV不同摩尔配比后的酶活性变化的比较结果 | 第63-65页 |
| 3.3.5 问号钩体rHslUV具有蛋白酶体糜蛋白酶样酶活性 | 第65页 |
| 3.3.6 蛋白酶体抑制剂对问号钩体rHslUV酶活性具有阻断作用 | 第65-66页 |
| 3.3.7 标准曲线绘制 | 第66-67页 |
| 3.3.8 问号钩体rHslUV酶动力学参数 | 第67-68页 |
| 3.4 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 感染细胞前后问号钩体hslU和hslV基因表达差异的检测 | 第69-77页 |
| 4.1 前言 | 第69页 |
| 4.2 材料与方法 | 第69-75页 |
| 4.2.1 主要仪器及试剂 | 第69-70页 |
| 4.2.2 实验菌株与细胞株 | 第70页 |
| 4.2.3 问号钩体感染细胞模型 | 第70-71页 |
| 4.2.4 问号钩体的收集 | 第71页 |
| 4.2.5 问号钩体RNA提取 | 第71-72页 |
| 4.2.6 RNA的定量与反转录 | 第72-73页 |
| 4.2.7 实时荧光定量PCR | 第73-74页 |
| 4.2.8 Western Blot法检测目标蛋白 | 第74页 |
| 4.2.9 统计学分析方法 | 第74-75页 |
| 4.3 实验结果与小结 | 第75-77页 |
| 4.3.1 RT-qPCR引物序列及相应熔解曲线和扩增效率分析 | 第75页 |
| 4.3.2 感染细胞前后问号钩体蛋白酶体基因表达差异的检测 | 第75-77页 |
| 第五章 问号钩体蛋白酶体基因缺失突变株的构建及鉴定 | 第77-90页 |
| 5.1 前言 | 第77页 |
| 5.2 材料与方法 | 第77-86页 |
| 5.2.1 主要仪器及试剂 | 第77-78页 |
| 5.2.2 钩体的培养 | 第78-79页 |
| 5.2.3 自杀质粒的构建 | 第79-81页 |
| 5.2.4 钩体基因敲除突变体的筛选与鉴定 | 第81-86页 |
| 5.3 钩体基因敲除突变体的鉴定结果 | 第86-89页 |
| 5.3.1 钩体基因敲除突变体的筛选 | 第86-87页 |
| 5.3.2 钩体基因敲除突变体的鉴定 | 第87页 |
| 5.3.3 钩体C△hslUV基因敲除突变体的筛选与鉴定 | 第87-89页 |
| 5.4 小结 | 第89-90页 |
| 第六章 感染细胞前后不同问号钩体胞内变性蛋白变化水平检测 | 第90-96页 |
| 6.1 前言 | 第90-91页 |
| 6.2 材料与方法 | 第91-94页 |
| 6.2.1 主要仪器及试剂 | 第91-92页 |
| 6.2.2 问号钩体及细胞株的培养 | 第92页 |
| 6.2.3 问号钩体感染细胞模型 | 第92-93页 |
| 6.2.4 问号钩体的收集 | 第93页 |
| 6.2.5 问号钩体胞内变性蛋白检测 | 第93-94页 |
| 6.3 实验结果 | 第94-95页 |
| 6.3.1 不同问号钩体胞内变性蛋白的检测 | 第94-95页 |
| 6.4 小结 | 第95-96页 |
| 第七章 感染宿主后不同问号钩体活力和致病力比较 | 第96-107页 |
| 7.1 前言 | 第96页 |
| 7.2 材料与方法 | 第96-100页 |
| 7.2.1 主要仪器、试剂及耗材 | 第96页 |
| 7.2.2 问号钩体、细胞株及实验动物 | 第96-97页 |
| 7.2.3 问号钩体的收集 | 第97页 |
| 7.2.4 问号钩体感染细胞模型 | 第97页 |
| 7.2.5 有关钩体活力与荧光强度关系的标准曲线绘制 | 第97-98页 |
| 7.2.6 荧光分光光度计法检测钩体活力 | 第98页 |
| 7.2.7 激光共聚焦显微镜法检测钩体活力 | 第98页 |
| 7.2.8 不同钩体感染J774A.1细胞后生长情况分析 | 第98-99页 |
| 7.2.9 问号钩体感染动物模型 | 第99页 |
| 7.2.10 动物组织病理学检查及组织中钩体载量检测 | 第99页 |
| 7.2.11 动物血液和尿液中钩体数量检测 | 第99-100页 |
| 7.3 实验结果 | 第100-106页 |
| 7.3.1 不同钩体感染J774A.1细胞后钩体活力检测 | 第100-101页 |
| 7.3.2 不同钩体感染J774A.1细胞后钩体生长情况检测 | 第101-102页 |
| 7.3.3 不同钩体的LD_(50)值测定 | 第102-103页 |
| 7.3.4 不同钩体对金地鼠肺、肝、肾组织的病理学损伤情况 | 第103页 |
| 7.3.5 感染不同钩体后金地鼠肺、肝、肾、血液及尿液中钩体载量情况 | 第103-106页 |
| 7.4 小结 | 第106-107页 |
| 第八章 感染细胞前后不同问号钩体胞内变性蛋白的提取及鉴定 | 第107-118页 |
| 8.1 前言 | 第107-108页 |
| 8.2 材料与方法 | 第108-115页 |
| 8.2.1 主要仪器及试剂 | 第108-109页 |
| 8.2.2 问号钩体及细胞株的培养 | 第109页 |
| 8.2.3 问号钩体感染细胞模型 | 第109-110页 |
| 8.2.4 问号钩体的收集 | 第110页 |
| 8.2.5 问号钩体胞内变性蛋白的提取 | 第110-111页 |
| 8.2.6 蛋白定量(Bradford法) | 第111页 |
| 8.2.7 蛋白酶解(Filter Aided Sample Preparation,FASP) | 第111-112页 |
| 8.2.8 iTRAQ标记 | 第112页 |
| 8.2.9 酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析 | 第112-113页 |
| 8.2.10 质谱数据分析 | 第113-114页 |
| 8.2.11 数据的生物信息解析(功能分析) | 第114-115页 |
| 8.3 实验结果 | 第115-117页 |
| 8.3.1 钩体变性蛋白鉴定结果 | 第115页 |
| 8.3.2 钩体变性蛋白聚类分析 | 第115-116页 |
| 8.3.3 钩体变性蛋白KEGG和GO富集分析 | 第116-117页 |
| 8.4 小结 | 第117-118页 |
| 结果与讨论 | 第118-121页 |
| 参考文献 | 第121-130页 |
| 综述 | 第130-151页 |
| References | 第141-151页 |
| 附录一 | 第151-153页 |
| 附录二 | 第153-156页 |
| 附录三 | 第156-163页 |
| 作者简历与攻读学位期间取得的科研成果 | 第163页 |
