| 摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-21页 |
| 缩语表(ABBREVIATION) | 第21-23页 |
| 第1章 文献综述 | 第23-40页 |
| ·猪肺炎支原体的流行病学及危害 | 第24-25页 |
| ·猪肺炎支原体病原学研究进展 | 第25-33页 |
| ·病原学特征 | 第26页 |
| ·基因组结构 | 第26-27页 |
| ·细菌的分离鉴定与培养特性 | 第27页 |
| ·病原菌的生化特性和理化特征 | 第27-28页 |
| ·猪肺炎支原体的主要免疫原分析 | 第28-30页 |
| ·病理变化和致病机制研究 | 第30-33页 |
| ·病理变化特征 | 第30-31页 |
| ·致病机制研究 | 第31-33页 |
| ·诊断方法 | 第33-36页 |
| ·实验室诊断 | 第33-35页 |
| ·病原菌的分离鉴定进行诊断 | 第33页 |
| ·抗原检测 | 第33页 |
| ·分子检测方法 | 第33-35页 |
| ·血清学诊断 | 第35页 |
| ·临床诊断 | 第35-36页 |
| ·预防与控制 | 第36-38页 |
| ·药物 | 第36页 |
| ·疫苗 | 第36-38页 |
| ·疫苗研究进展 | 第36-37页 |
| ·疫苗的免疫保护机制 | 第37-38页 |
| ·综合防制 | 第38页 |
| ·猪肺炎支原体感染与免疫研究的趋势 | 第38-40页 |
| 第2章 猪肺炎支原体的分离鉴定 | 第40-64页 |
| ·实验材料 | 第40-42页 |
| ·病料来源 | 第40页 |
| ·细菌菌种 | 第40页 |
| ·实验动物 | 第40页 |
| ·载体与质粒 | 第40-41页 |
| ·主要试剂与药品 | 第41页 |
| ·主要培养基及其配制 | 第41-42页 |
| ·试验方法 | 第42-49页 |
| ·PCR检测 | 第42-44页 |
| ·引物的设计与合成 | 第42-43页 |
| ·PCR产物琼脂糖凝胶电泳及检测 | 第43页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第43-44页 |
| ·黏附素基因在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第44-46页 |
| ·DNA片段与载体酶切连接 | 第44页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第44页 |
| ·连接产物及质粒的转化 | 第44-45页 |
| ·重组质粒的PCR和酶切鉴定 | 第45页 |
| ·质粒的制备 | 第45页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE检测和Western blot检测 | 第46页 |
| ·黏附素蛋白多克隆抗体的制备 | 第46-47页 |
| ·菌落观察 | 第47页 |
| ·电镜负染观察 | 第47页 |
| ·分离株P36、P46和16 sRNA扩增产物的测序 | 第47页 |
| ·基因进化分析 | 第47页 |
| ·动物回归试验 | 第47-49页 |
| ·颜色变化单位(Colour Change Unit,CCU)的测定 | 第47-48页 |
| ·分离菌株的人工感染 | 第48页 |
| ·体温测定 | 第48页 |
| ·生长状况的测定 | 第48页 |
| ·血清抗体的检测 | 第48-49页 |
| ·临床病变观察 | 第49页 |
| ·抗原检测 | 第49页 |
| ·病理切片和免疫组化分析 | 第49页 |
| ·结果 | 第49-61页 |
| ·临床样本的PCR检测 | 第49-50页 |
| ·黏附素基因克隆表达 | 第50-52页 |
| ·黏附素基因克隆表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·黏附素基因的表达与纯化 | 第51页 |
| ·黏附素基因的Western-blot鉴定 | 第51-52页 |
| ·黏附素蛋白抗血清 | 第52页 |
| ·猪肺炎支原体的分离鉴定 | 第52-56页 |
| ·菌落特征与细菌形态 | 第52页 |
| ·电镜付染观察菌落形态 | 第52-53页 |
| ·PCR扩增 | 第53-54页 |
| ·基因测序分析 | 第54-55页 |
| ·基因进化分析 | 第55-56页 |
| ·动物回归试验结果 | 第56-61页 |
| ·CCU滴度的测定 | 第56页 |
| ·体温监测结果 | 第56-57页 |
| ·生长指标的测定 | 第57-58页 |
| ·感染后的抗体水平 | 第58页 |
| ·感染后的临床表现 | 第58-59页 |
| ·病原检测 | 第59页 |
| ·病理组织切片分析 | 第59页 |
| ·免疫组化分析结果 | 第59-61页 |
| ·讨论 | 第61-64页 |
| ·猪肺炎支原体的严重性 | 第61-62页 |
| ·猪肺炎支原体的分离与鉴定方法 | 第62页 |
| ·动物回归实验 | 第62-64页 |
| ·感染后的临床表现 | 第62-63页 |
| ·感染和血清学转化 | 第63页 |
| ·病理切片及免疫组化分析 | 第63-64页 |
| 第3章 猪肺炎支原体REAL-TIME PCR检测方法的建立与应用 | 第64-72页 |
| ·实验材料 | 第64-65页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第64-65页 |
| ·实验用菌株 | 第65页 |
| ·实验动物 | 第65页 |
| ·主要培养基及其配置 | 第65页 |
| ·实验方法 | 第65-67页 |
| ·引物及TaqMan探针的合成 | 第65页 |
| ·标准品的制备 | 第65-66页 |
| ·标准质粒的提取 | 第65-66页 |
| ·标准质粒浓度的计算 | 第66页 |
| ·实时荧光定量PCR检测方法的建立 | 第66页 |
| ·标准曲线的建立 | 第66页 |
| ·特异性实验 | 第66页 |
| ·准确性实验 | 第66页 |
| ·重复性实验 | 第66页 |
| ·样本的检测 | 第66-67页 |
| ·实验结果 | 第67-70页 |
| ·常规PCR建立 | 第67页 |
| ·标准曲线的建立和回归方程的设定 | 第67-68页 |
| ·荧光定量PCR特异性实验 | 第68页 |
| ·荧光定量PCR准确性和重复性 | 第68-69页 |
| ·荧光定量PCR与普通PCR的比较 | 第69-70页 |
| ·样本的检测 | 第70页 |
| ·讨论 | 第70-72页 |
| 第4章 猪肺炎支原体重组猪霍乱沙门氏菌基因工程疫苗的研究 | 第72-116页 |
| ·材料 | 第72-74页 |
| ·实验菌种和质粒 | 第72页 |
| ·主要药品和试剂 | 第72-73页 |
| ·主要培养基及试剂的配置 | 第73-74页 |
| ·主要培养基的配置 | 第73页 |
| ·SDS-PAGE和Western blotting相关溶液配置 | 第73页 |
| ·GST融合蛋白纯化缓冲液 | 第73页 |
| ·ELISA相关溶液的配置 | 第73页 |
| ·其它溶液的配置 | 第73-74页 |
| ·实验动物 | 第74页 |
| ·方法 | 第74-81页 |
| ·猪肺炎支原体抗原基因序列分析及其引物的合成 | 第74-75页 |
| ·PCR模板的制备 | 第75-76页 |
| ·主要免疫原性基因的扩增 | 第76页 |
| ·PCR或酶切产物的回收与纯化 | 第76页 |
| ·大肠杆菌JM105和X7213感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第76页 |
| ·连接产物的转化 | 第76页 |
| ·沙门氏菌电转感受态细胞的制备 | 第76页 |
| ·电转化 | 第76-77页 |
| ·质粒的小量制备 | 第77页 |
| ·重组菌的鉴定 | 第77页 |
| ·重组大肠杆菌JM105的表达、纯化及活性鉴定 | 第77页 |
| ·重组沙门氏菌的构建与鉴定 | 第77页 |
| ·重组沙门氏菌的表达及活性鉴定 | 第77页 |
| ·重组沙门氏菌生长特性分析 | 第77页 |
| ·重组沙门氏菌表型和遗传稳定性鉴定 | 第77页 |
| ·间接ELISA检测方法的建立 | 第77-78页 |
| ·重组菌的小鼠免疫原性试验 | 第78-80页 |
| ·四种不同重组沙门氏菌免疫小鼠 | 第78页 |
| ·特异性抗体的检测 | 第78-79页 |
| ·细胞免疫检测 | 第79-80页 |
| ·用ELISA试剂盒测定小鼠免疫后猪肺炎支原体的抗体含量 | 第80页 |
| ·重组菌的仔猪免疫效力试验 | 第80-81页 |
| ·重组沙门氏菌免疫仔猪 | 第80页 |
| ·血清中特异性抗体的检测 | 第80页 |
| ·免疫猪血清中IgG1和IgG2a的检测 | 第80页 |
| ·用ELISA试剂盒测定仔猪免疫后猪肺炎支原体的抗体滴度 | 第80-81页 |
| ·攻毒后炎性细胞因子检测 | 第81页 |
| ·临床症状观察 | 第81页 |
| ·病理组织切片分析 | 第81页 |
| ·统计学分析 | 第81页 |
| ·实验结果与分析 | 第81-110页 |
| ·猪肺炎支原体抗原基因序列分析 | 第81-83页 |
| ·P46和P65基因的定点突变 | 第83-84页 |
| ·在大肠杆菌表达中的表达及反应原性分析 | 第84-86页 |
| ·P46/P65/P36/P97R1NrdF基因片段分别在E.coli表达载体的构建 | 第84-85页 |
| ·SDS-PAGE分析重组蛋白分别在E.coli中的表达与纯化 | 第85-86页 |
| ·Western blotting分析重组蛋白分别在E.coli中的活性 | 第86页 |
| ·重组沙门氏菌的构建与鉴定 | 第86-90页 |
| ·P46/P65/P36/P97R1NrdF基因片段分别在C501表达载体的构建 | 第86-87页 |
| ·重组沙门氏菌的鉴定 | 第87页 |
| ·重组沙门氏菌的分泌表达 | 第87-88页 |
| ·重组沙门氏菌生长特性分析结果 | 第88页 |
| ·重组沙门氏菌表型及遗传稳定性分析 | 第88-90页 |
| ·四种不同重组沙门氏菌对小鼠的免疫原性测定 | 第90-98页 |
| ·重组菌C501(pYAP46)对小鼠的免疫实验 | 第90页 |
| ·重组菌C501(pYAP65)对小鼠的免疫实验 | 第90-91页 |
| ·重组菌C501(pYAP36)对小鼠的免疫实验 | 第91-93页 |
| ·重组菌C501(pYAP97R1N)对小鼠的免疫实验 | 第93-96页 |
| ·比较四种沙门重组菌免疫小鼠后特异性的抗体水平 | 第96页 |
| ·比较四种沙门重组疫苗免疫小鼠后M.hyo抗体检测 | 第96-97页 |
| ·比较四种沙门重组菌免疫小鼠后IL-4和IFN-γ细胞因子检测 | 第97-98页 |
| ·两种重组疫苗对仔猪的免疫效力测定 | 第98-110页 |
| ·重组疫苗免疫仔猪后M.hyo抗体的测定 | 第98页 |
| ·重组疫苗免疫仔猪后特异性IgM抗体的测定 | 第98页 |
| ·重组疫苗免疫仔猪后特异性IgA抗体的测定 | 第98-100页 |
| ·重组疫苗免疫仔猪后特异性IgG抗体的测定 | 第100页 |
| ·重组疫苗免疫仔猪后IgG亚类的测定 | 第100-101页 |
| ·攻毒保护试验 | 第101-110页 |
| ·讨论 | 第110-116页 |
| ·重组疫苗诱导小鼠的免疫原性 | 第110-112页 |
| ·重组疫苗C501(pYAP46)对小鼠的免疫效力 | 第111页 |
| ·重组疫苗C501(pYAP65)对小鼠的免疫效力 | 第111页 |
| ·重组疫苗C501(pYAP36)对小鼠的免疫效力 | 第111-112页 |
| ·重组疫苗C501(pYAP97R1N)对小鼠的免疫效力 | 第112页 |
| ·重组疫苗诱导的细胞免疫反应 | 第112-113页 |
| ·重组疫苗诱导仔猪的免疫保护 | 第113-114页 |
| ·猪肺炎支原体免疫保护机制 | 第114页 |
| ·展望 | 第114-116页 |
| 第5章 猪支原体肺炎重组猪胸膜肺炎放线杆菌弱毒株基因工程疫苗的初步研究 | 第116-135页 |
| ·实验材料 | 第116-119页 |
| ·细菌菌株 | 第116-117页 |
| ·载体与质粒 | 第117-118页 |
| ·主要药品及试剂 | 第118页 |
| ·主要培养基和试剂的配置 | 第118-119页 |
| ·主要培养基的配置 | 第118页 |
| ·SDS-PAGE和Western blotting相关缓冲液的配置 | 第118-119页 |
| ·ELISA相关溶液的配置 | 第119页 |
| ·其它溶液的配置 | 第119页 |
| ·实验动物 | 第119页 |
| ·实验方法 | 第119-123页 |
| ·本研究中所用的寡核苷酸引物(表5-1) | 第119-120页 |
| ·PCR模板的制备 | 第120页 |
| ·基因的扩增 | 第120页 |
| ·PCR或酶切产物的回收与纯化 | 第120页 |
| ·大肠杆菌DH5a和X7213感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第120页 |
| ·连接产物的转化 | 第120页 |
| ·质粒的小量制备 | 第120-121页 |
| ·重组质粒的PCR和酶切鉴定 | 第121页 |
| ·接合转移方法进行同源重组 | 第121页 |
| ·突变株的鉴定 | 第121页 |
| ·突变株生物学活性鉴定 | 第121-122页 |
| ·脲酶活性鉴定 | 第121页 |
| ·SDS-PAGE和Western-blotting鉴定 | 第121页 |
| ·突变株遗传稳定性分析 | 第121-122页 |
| ·突变株生长特性分析 | 第122页 |
| ·突变株对小鼠致病力分析 | 第122页 |
| ·突变株对小鼠免疫效力的测定 | 第122页 |
| ·疫苗菌株的准备 | 第122页 |
| ·突变株对小鼠的免疫反应试验 | 第122页 |
| ·血清抗体检测 | 第122-123页 |
| ·统计分析 | 第123页 |
| ·结果分析 | 第123-131页 |
| ·重组质粒的构建 | 第123-126页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌UreC上下臂基因的PCR扩增 | 第123页 |
| ·肺炎支原体P36基因和启动子Ner的扩增 | 第123页 |
| ·重组质粒pEUN36的构建 | 第123-125页 |
| ·重组质粒pEIU、pUN36和pEUN36的酶切鉴定 | 第125-126页 |
| ·结合转移进行同源重组筛选突变株 | 第126-127页 |
| ·突变株的生物学特性 | 第127-130页 |
| ·突变株丧失脲酶活性 | 第127页 |
| ·P36基因的表达 | 第127-128页 |
| ·突变株的遗传稳定性分析 | 第128-129页 |
| ·突变株的生长特性分析 | 第129页 |
| ·P36基因在突变株中的稳定表达 | 第129-130页 |
| ·突变株对小鼠致病力的分析 | 第130页 |
| ·突变株对小鼠的免疫效果分析 | 第130-131页 |
| ·讨论 | 第131-135页 |
| ·细菌疫苗载体技术 | 第131-132页 |
| ·猪的呼吸道疾病综合症 | 第132页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌弱毒株的研究 | 第132-133页 |
| ·异源基因的表达 | 第133-134页 |
| ·展望 | 第134-135页 |
| 第6章 结论 | 第135-136页 |
| 参考文献 | 第136-154页 |
| 附录 | 第154-156页 |
| 致谢 | 第156页 |
