| 正文目录 | 第1-8页 |
| 图片目录 | 第8-10页 |
| 表格目录 | 第10-11页 |
| 中文摘要 | 第11-14页 |
| 英文摘要 | 第14-17页 |
| 第一章 逆转录病毒介导的RNA干扰技术的建立 | 第17-51页 |
| 摘要 | 第19-20页 |
| 1 引言 | 第20-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-33页 |
| ·实验材料 | 第22-25页 |
| ·菌株 | 第22页 |
| ·质粒 | 第22-23页 |
| ·细胞系 | 第23页 |
| ·DNA oligos序列 | 第23-24页 |
| ·PCR引物序列 | 第24页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第24-25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·实验方法 | 第25-33页 |
| ·DNA oligos的退火处理 | 第25页 |
| ·质粒的构建 | 第25-27页 |
| ·细胞培养 | 第27-28页 |
| ·病毒包装与转导 | 第28-29页 |
| ·Western blotting检测蛋白的表达水平 | 第29-32页 |
| ·荧光定量PCR(real time PCR) | 第32-33页 |
| 3 结果 | 第33-41页 |
| ·逆转录病毒介导的靶向P53基因的RNA干扰实验流程 | 第33-34页 |
| ·融合逆转录病毒载体的构建 | 第34-35页 |
| ·单克隆抗性细胞库的建立 | 第35-36页 |
| ·单克隆抗性细胞中P53基因表达的Western印迹分析 | 第36-38页 |
| ·二次转染细胞中P53基因表达的Western印迹分析 | 第38-40页 |
| ·二次转染细胞中多腺苷酸合成酶1(OAS1)基因的表达 | 第40-41页 |
| 4 讨论 | 第41-46页 |
| ·逆转录病毒介导体系易于导入细胞和筛选稳定克隆 | 第41-42页 |
| ·逆转录病毒载体介导的RNA干扰体系具有特异性、高效性和稳定性 | 第42-43页 |
| ·逆转录病毒介导的RNA干扰不会引起抗病毒防御机制 | 第43-44页 |
| ·逆转录病毒介导的RNA干扰技术应用前景广阔 | 第44-46页 |
| 参考文献 | 第46-51页 |
| 第二章 逆转录病毒介导的RNA干扰对HepG2细胞中HBV基因表达的抑制作用 | 第51-79页 |
| 摘要 | 第53-54页 |
| 1 引言 | 第54-55页 |
| 2 材料与方法 | 第55-64页 |
| ·实验材料 | 第55-58页 |
| ·菌株、质粒、细胞系 | 第55-57页 |
| ·DNA oligos序列的设计与合成 | 第57页 |
| ·PCR引物序列 | 第57-58页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第58页 |
| ·主要仪器 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-64页 |
| ·DNA oligos的退火处理 | 第58页 |
| ·质粒的构建 | 第58-59页 |
| ·细胞培养 | 第59页 |
| ·病毒包装与转导 | 第59页 |
| ·检测HepG2细胞中表达盒整合情况 | 第59-60页 |
| ·用topo-HBV质粒转染HepG2细胞 | 第60页 |
| ·ELISA法分析HepG2细胞上清中HBsAg和HBeAg水平 | 第60页 |
| ·Northern blot分析HepG2细胞中HBV mRNA水平 | 第60-64页 |
| 3 结果 | 第64-72页 |
| ·逆转录病毒介导的靶向HBV基因的RNA干扰实验流程 | 第64-65页 |
| ·SIRNA的设计 | 第65页 |
| ·融合逆转录病毒载体的构建 | 第65-67页 |
| ·抗性细胞库的形成及U6-siRNA表达盒的整合情况检测 | 第67-68页 |
| ·HepG2细胞中HBsAg和HBeAg蛋白质量分析 | 第68-70页 |
| ·HepG2细胞中HBV mRNA量的分析 | 第70-72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-79页 |
| 第三章 逆转录病毒介导的RNA干扰对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和复制的抑制 | 第79-99页 |
| 摘要 | 第81-82页 |
| 1 引言 | 第82-83页 |
| 2 材料与方法 | 第83-86页 |
| ·实验材料 | 第83页 |
| ·菌株、质粒和细胞系 | 第83页 |
| ·PCR引物、DNA oligos、主要试剂及试剂盒、主要仪器 | 第83页 |
| ·实验方法 | 第83-86页 |
| ·细胞培养 | 第83-84页 |
| ·病毒包装与转导 | 第84页 |
| ·检测2215细胞中表达盒整合情况 | 第84页 |
| ·ELISA法分析2215细胞培养基中ImsAg和HBeAg水平 | 第84页 |
| ·Northern blot分析2215细胞中HBV mRNA水平 | 第84页 |
| ·荧光定量PCR分析2215细胞上清中HBV DNA水平 | 第84-86页 |
| 3 结果 | 第86-94页 |
| ·融合逆转录病毒载体的构建 | 第86-87页 |
| ·抗性细胞库的建立及鉴定 | 第87-88页 |
| ·HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg的表达水平分析 | 第88-90页 |
| ·HepG2.2.15细胞中HBV mRNA水平分析 | 第90-91页 |
| ·HepG2.2.15细胞中HBV DNA水平分析 | 第91-94页 |
| 4 讨论 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-99页 |
| 第四章 修饰性RNA寡核苷酸毒性分析 | 第99-119页 |
| 摘要 | 第101-102页 |
| 1 引言 | 第102-103页 |
| 2 材料与方法 | 第103-106页 |
| ·实验材料 | 第103-104页 |
| ·RNA oligos | 第103页 |
| ·细胞系 | 第103页 |
| ·动物 | 第103页 |
| ·主要试剂 | 第103-104页 |
| ·主要仪器 | 第104页 |
| ·实验方法 | 第104-106页 |
| ·细胞培养 | 第104页 |
| ·细胞毒性分析 | 第104-105页 |
| ·动物毒性分析 | 第105页 |
| ·组织病理学分析 | 第105页 |
| ·cm-RNA oligos在动物组织器官中的分布分析 | 第105-106页 |
| 3 结果 | 第106-111页 |
| ·小分子RNA的安全性检测实验流程 | 第106页 |
| ·细胞毒性分析 | 第106-107页 |
| ·动物毒性分析 | 第107-109页 |
| ·组织病理学分析 | 第109-111页 |
| ·荧光标记的cm-RNAoligos在动物不同组织器官中的分布 | 第111页 |
| 4 讨论 | 第111-114页 |
| 参考文献 | 第114-119页 |
| 文献综述 RNA干扰技术及其应用 | 第119-146页 |
| RNA干扰技术及其应用 | 第121-139页 |
| 摘要 | 第121-122页 |
| 1 RNA干扰过程概述 | 第122页 |
| 2 RNA干扰机制研究 | 第122-126页 |
| ·内源性的mRNA是dsRNA作用的靶位点 | 第123页 |
| ·Dicer:RNA干扰的启动器 | 第123-124页 |
| ·RdRp:RNA干扰的催化剂 | 第124页 |
| ·RISC(RNA-induced silencing complex):干扰效应器复合物 | 第124-125页 |
| ·Argonaute:接头蛋白(Adaptor) | 第125页 |
| ·siRNA(Small interference RNA) | 第125-126页 |
| 3 哺乳动物细胞中实现RNA干扰的研究历程 | 第126-130页 |
| 4 实现RNA干扰的技术路线 | 第130-133页 |
| ·siRNA分子的设计 | 第130页 |
| ·siRNA分子的制备 | 第130-132页 |
| ·转染细胞和个体的方法 | 第132页 |
| ·分析RNAt的效果 | 第132-133页 |
| 5 RNAi在生物学和医学研究中的应用 | 第133-137页 |
| ·RNAi与基因功能研究 | 第133页 |
| ·RNAi与基因治疗 | 第133-136页 |
| ·RNAi与病毒感染的抑制 | 第134页 |
| ·RNAi与抗肿瘤治疗 | 第134-135页 |
| ·RNAi与神经退行性疾病 | 第135-136页 |
| ·RNAi与信号传导通路 | 第136页 |
| ·RNA干扰与发育调控 | 第136-137页 |
| 6 展望 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-146页 |
| 英文名词及缩写 | 第146-147页 |
| 致谢 | 第147-148页 |
| 在读期间发表的论文 | 第148-149页 |
