| 中文摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-27页 |
| 一、植物抗病毒基因工程策略和机制研究进展 | 第15-24页 |
| 1. 蛋白介导的抗性 | 第15-18页 |
| ·同源衣壳蛋白介导的抗性 | 第15-16页 |
| ·异源衣壳蛋白介导的抗性 | 第16-17页 |
| ·适体介导的抗性 | 第17-18页 |
| 2.R NA 介导的抗性 | 第18-24页 |
| ·转录后基因沉默 | 第18页 |
| ·小干扰RNA 途径 | 第18-20页 |
| ·RNA 和DNA 病毒中RNA 介导的抗性 | 第20-22页 |
| ·微RNA 途径 | 第22页 |
| ·人造微RNA 介导的抗性 | 第22-23页 |
| ·多基因策略 | 第23-24页 |
| 3. 抗病毒基因工程存在的问题 | 第24页 |
| 二、烟草脉带花叶病毒的研究进展 | 第24-26页 |
| 1.T VBMV 的生物学特性 | 第25页 |
| ·病毒的发生与分布 | 第25页 |
| ·传播方式与寄主范围 | 第25页 |
| 2.T VBMV 的分子生物学特性 | 第25-26页 |
| 3.T VBMV 与马铃薯X 病毒的协生作用 | 第26页 |
| 三、本研究的目的意义 | 第26-27页 |
| 第二章 适体策略介导的抗病毒研究 | 第27-64页 |
| 1. 材料与方法 | 第27-49页 |
| ·实验材料 | 第27-28页 |
| ·毒原纯化和保存 | 第27页 |
| ·供试植物 | 第27页 |
| ·菌种和质粒 | 第27页 |
| ·生化及分子生物学试剂 | 第27-28页 |
| ·寡聚核苷酸引物 | 第28页 |
| ·实验方法 | 第28-49页 |
| ·适体载体的构建 | 第28-39页 |
| ·农杆菌瞬时表达筛选最有效的抗性诱导载体 | 第39-40页 |
| ·农杆菌介导法转化烟草K326 | 第40-42页 |
| ·T0 代转基因烟草的分子鉴定 | 第42-47页 |
| ·T0 代转基因烟草的抗病性分析及ELISA 检测 | 第47-48页 |
| ·适体对病毒复制的影响 | 第48-49页 |
| 2. 结果与分析 | 第49-62页 |
| ·目的基因的扩增和克隆 | 第49页 |
| ·突变体的获得与序列测定 | 第49-50页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·农杆菌瞬时表达筛选最有效的抗性诱导载体 | 第51-52页 |
| ·农杆菌介导的基因转化和植株再生 | 第52页 |
| ·转基因植株的分子检测 | 第52-57页 |
| ·转基因植株外源基因和抗生素基因的PCR 检测 | 第52-54页 |
| ·转基因植株外源基因的实时荧光PCR 检测 | 第54-55页 |
| ·T0 代转基因烟草的RT-PCR 检测 | 第55页 |
| ·转基因烟草的荧光检测 | 第55页 |
| ·外源基因在T0 代转基因烟草中的相对表达量 | 第55-57页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第57-60页 |
| ·实时荧光RT-PCR 检测适体对病毒复制的影响 | 第60-62页 |
| ·实时荧光RT-PCR 引物特异性检测 | 第60页 |
| ·适体对PVY 和CMV 复制的影响 | 第60-62页 |
| 3. 讨论 | 第62-64页 |
| 第三章 siRNA介导的抗病毒研究 | 第64-82页 |
| 1. 材料与方法 | 第64-72页 |
| ·实验材料 | 第64-65页 |
| ·毒原纯化和保存 | 第64页 |
| ·供试植物 | 第64页 |
| ·菌种和质粒 | 第64页 |
| ·生化及分子生物学试剂 | 第64-65页 |
| ·寡聚核苷酸引物 | 第65页 |
| ·实验方法 | 第65-72页 |
| ·siRNA 载体的构建 | 第65-71页 |
| ·农杆菌介导法转化烟草K326 | 第71页 |
| ·T0 代转基因烟草的分子鉴定 | 第71页 |
| ·T0 代转基因烟草的抗病性分析及ELISA 检测 | 第71页 |
| ·siRNA 对病毒复制的影响 | 第71-72页 |
| 2. 结果与分析 | 第72-80页 |
| ·siRNA 的筛选 | 第72-73页 |
| ·siRNA 植物表达载体的构建 | 第73-75页 |
| ·siRNA 植物表达载体转化烟草K326 | 第75页 |
| ·转基因植株的分子检测 | 第75-76页 |
| ·转基因植株外源基因的PCR 检测 | 第75-76页 |
| ·转基因植株抗生素基因的PCR 检测 | 第76页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第76-78页 |
| ·实时荧光RT-PCR 检测siRNA 对病毒复制的影响 | 第78-80页 |
| 3. 讨论 | 第80-82页 |
| 第四章 TVBMV 全基因组序列测定、蛋白表达纯化和抗血清的制备 | 第82-117页 |
| 1. 材料与方法 | 第82-96页 |
| ·实验材料 | 第82-83页 |
| ·样品采集与保存 | 第82页 |
| ·菌种和质粒 | 第82-83页 |
| ·生化及分子生物学试剂 | 第83页 |
| ·寡聚核苷酸引物 | 第83页 |
| ·实验方法 | 第83-96页 |
| ·TVBMV YND 分离物CP 基因的原核表达和抗血清制备 | 第83-89页 |
| ·TVBMV YND 分离物全基因组测定 | 第89页 |
| ·TVBMV YND 分离物基因的原核表达和纯化 | 第89-96页 |
| 2. 结果与分析 | 第96-113页 |
| ·TVBMV YND 分离物CP 基因的原核表达和抗血清的制备 | 第96-101页 |
| ·基因的扩增及克隆 | 第96页 |
| ·序列测定与分析 | 第96-97页 |
| ·TVBMV CP 基因的原核表达 | 第97-99页 |
| ·抗血清的制备及其效价、特异性测定 | 第99-101页 |
| ·TVBMV YND 分离物全基因组序列测定 | 第101-102页 |
| ·TVBMV YND 分离物基因的原核表达和纯化 | 第102-113页 |
| ·TVBMV YND 分离物基因的扩增与克隆 | 第102-103页 |
| ·TVBMV YND 分离物基因的序列测定与分析 | 第103页 |
| ·TVBMV YND 分离物基因的原核表达 | 第103-105页 |
| ·TVBMV YND 分离物融合蛋白的荧光测定 | 第105-106页 |
| ·TVBMV YND 分离物融合蛋白诱导表达条件的优化 | 第106-108页 |
| ·TVBMV YND 分离物融合蛋白的可溶性分析 | 第108-109页 |
| ·TVBMV YND 分离物融合蛋白的纯化 | 第109-110页 |
| ·TVBMV YND 分离物编码蛋白的生物信息学分析 | 第110-113页 |
| 3. 讨论 | 第113-117页 |
| 全文结论 | 第117-118页 |
| 参考文献 | 第118-132页 |
| 致谢 | 第132-133页 |
| 攻读博士期间发表论文情况 | 第133页 |
