| 独创性声明 | 第1页 |
| 论文使用授权的说明 | 第3-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩写词 | 第12-13页 |
| 引言 | 第13-21页 |
| 1 植物乙醇脱氢酶(ADH)的功能及其基因表达调控 | 第13-17页 |
| ·ADH与胚(种子)发育的关系 | 第13-15页 |
| ·ADH与种子萌发 | 第15页 |
| ·ADH与植物的离体再生 | 第15页 |
| ·ADH与果实的生长发育 | 第15-16页 |
| ·ADH与花粉发育、萌发 | 第16页 |
| ·乙醇脱氢酶基因在逆境条件下的诱导表达调控 | 第16-17页 |
| ·Adh基因的启动子反应元件及其诱导表达的信号转导机制 | 第16-17页 |
| ·Adh基因的组织、时空特异表达 | 第17页 |
| 2 ADH酶蛋白的分离纯化及其生化特性研究 | 第17-19页 |
| 3 本研究的目的、内容和技术路线 | 第19-21页 |
| 第一章 龙眼离体胚中类糖醇脱氢酶分离纯化方法的建立 | 第21-35页 |
| 1 材料与方法 | 第21-24页 |
| ·仪器与试剂 | 第21页 |
| ·材料 | 第21-22页 |
| ·类糖醇脱氢酶的提取、盐析和柱层析分离 | 第22-23页 |
| ·蛋白质的提取与盐析 | 第22页 |
| ·蛋白质样品过柱除盐 | 第22页 |
| ·DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离 | 第22页 |
| ·DEAE-52柱层析分离 | 第22页 |
| ·Phenyl Sepharose High Performance柱层析分离 | 第22页 |
| ·Q-Sepharose High Performance柱层析分离 | 第22-23页 |
| ·Superdex 200 prep grade柱层析分离 | 第23页 |
| ·类糖醇脱氢酶在层析柱后活性的检测 | 第23页 |
| ·蛋白质样品的电泳及检测 | 第23-24页 |
| ·蛋白质样品的电泳分离 | 第23页 |
| ·电泳后的检测 | 第23-24页 |
| 2 结果和分析 | 第24-33页 |
| ·龙眼EC中类糖醇脱氢酶的生化反应特性 | 第24-25页 |
| ·不同pH、不同辅酶对龙眼EC中类糖醇脱氢酶染色强度(活性)的影响 | 第24页 |
| ·不同的染料对染色强度(活性)的影响 | 第24-25页 |
| ·类糖醇脱氢酶在龙眼体胚发生不同阶段的表达变化 | 第25页 |
| ·类糖醇脱氢酶在柱层析分离后的活性丧失及其稳定 | 第25-27页 |
| ·DTT浓度对酶活性的影响 | 第25-26页 |
| ·酶在层析分离后的活性丧失及其稳定 | 第26-27页 |
| ·龙眼类糖醇脱氢酶分离纯化策略的探索建立 | 第27-33页 |
| ·龙眼类糖醇脱氢酶的初步纯化 | 第27-29页 |
| ·龙眼类糖醇脱氢酶分离纯化体系的进一步优化 | 第29-33页 |
| 3 小结与讨论 | 第33-35页 |
| ·类糖醇脱氢酶的分子特性 | 第33页 |
| ·龙眼EC中类糖醇脱氢酶在体外的稳定 | 第33-34页 |
| ·龙眼EC中无底物依赖型脱氢酶在不同分离介质中的分离特性 | 第34页 |
| ·龙眼EC中类糖醇脱氢酶分离纯化顺序 | 第34-35页 |
| 第二章 龙眼类糖醇脱氢酶Lc.A和Lc.B的分离纯化 | 第35-42页 |
| 1 材料与方法 | 第35-37页 |
| ·蛋白的提取、盐析和脱盐 | 第35页 |
| ·DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离 | 第35页 |
| ·DEAE-52柱层析分离 | 第35-36页 |
| ·Phenyl Sepharose柱层析分离 | 第36页 |
| ·Superdex 200柱层析分离 | 第36页 |
| ·离心超滤浓缩 | 第36页 |
| ·酶活性的检测 | 第36页 |
| ·蛋白质电泳检测 | 第36-37页 |
| ·常规非变性PAGE | 第36页 |
| ·非变性梯度胶PAGE | 第36页 |
| ·SDS-PAGE | 第36页 |
| ·电泳后的检测 | 第36-37页 |
| 2 结果与分析 | 第37-41页 |
| ·Lc.A和Lc.B的DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离 | 第37页 |
| ·Lc.A和Lc.B的DEAE-52柱层析分离 | 第37-38页 |
| ·Lc.A和Lc.B的Phenyl Sepharose柱层析分离 | 第38-39页 |
| ·Lc.A和Lc.B的Superdex 200柱层析 | 第39-41页 |
| 3 小结与讨论 | 第41-42页 |
| 第三章 Lc.A和Lc.B的质谱鉴定及其在龙眼体胚发生中活性变化的再证实 | 第42-61页 |
| 1 Lc.A和Lc.B的肽质量指纹分析、串连质谱测序和蛋白质鉴定 | 第43-56页 |
| ·材料与方法 | 第43-44页 |
| ·样品的SDS-PAGE | 第43页 |
| ·蛋白质(肽)的原位酶解 | 第43页 |
| ·肽段的提取 | 第43-44页 |
| ·MALDI-TOF质谱分析 | 第44页 |
| ·ESI-Q-TOF2串联质谱测序 | 第44页 |
| ·结果与分析 | 第44-56页 |
| ·Lc.A和Lc.B的MALDI-TOF分析 | 第44-48页 |
| ·Lc.B的Q-TOF2分析及蛋白质鉴定 | 第48-52页 |
| ·Lc.A的Q-TOF2分析及蛋白质鉴定 | 第52-55页 |
| ·Lc.B和Lc.A串联质谱得到的肽段与已知序列的多重对齐分析 | 第55-56页 |
| 2 龙眼体胚发生过程中乙醇脱氢酶活性的变化 | 第56-58页 |
| ·材料与方法 | 第56-57页 |
| ·材料 | 第56-57页 |
| ·方法 | 第57页 |
| ·结果与分析 | 第57-58页 |
| 3 小结与讨论 | 第58-61页 |
| ·Lc.A和Lc.B是ADH同工酶的两个组分 | 第58页 |
| ·Lc.A和Lc.B与已知的ADH的氨基酸序列具很高的同源性 | 第58页 |
| ·ADH可能与龙眼早期的离体胚发生或维持其愈伤组织的高再生能力有关 | 第58-59页 |
| ·Lc.A和Lc.B的N-末端可能为乙酰化封闭 | 第59页 |
| ·龙眼中的乙醇脱氢酶Lc.A和Lc.B的生化特性 | 第59-61页 |
| 第四章 龙眼胚性愈伤组织ADH cDNA的克隆及原核表达 | 第61-84页 |
| 1 材料与方法 | 第61-70页 |
| ·仪器与试剂 | 第61页 |
| ·龙眼总RNA的提取 | 第61-62页 |
| ·EC总RNA的提取 | 第61-62页 |
| ·合子胚总RNA的提取 | 第62页 |
| ·EC中ADH cDNA保守区的克隆 | 第62-65页 |
| ·cDNA的合成 | 第62-63页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第63-64页 |
| ·目的片段与T载体连接、转化及鉴定 | 第64页 |
| ·质粒的提取与测序 | 第64-65页 |
| ·EC中ADH cDNA的3'-RACE | 第65-66页 |
| ·cDNA的合成 | 第65页 |
| ·3'-RACE | 第65-66页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第66页 |
| ·目的片段与T载体连接、转化及鉴定 | 第66页 |
| ·EC中ADH的5'-RACE | 第66-68页 |
| ·RNA的逆转录 | 第66页 |
| ·柱纯化cDNA第一链合成产物 | 第66-67页 |
| ·cDNA第一链3'端加尾 | 第67页 |
| ·柱纯化cDNA第一链3'端加尾产物 | 第67页 |
| ·cDNA第二链的合成 | 第67页 |
| ·PCR扩增反应 | 第67-68页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第68页 |
| ·目的片段与T载体连接、转化及鉴定 | 第68页 |
| ·ADH cDNA在大肠杆菌中的表达 | 第68-70页 |
| ·ADH cDNA全开放阅读框的克隆 | 第68-70页 |
| ·p15-ADH转化至大肠杆菌表达宿主及诱导表达 | 第70页 |
| 2 结果和分析 | 第70-83页 |
| ·龙眼EC中抽提的总RNA的质量 | 第70-71页 |
| ·ADH cDNA保守区的克隆 | 第71-72页 |
| ·ADH cDNA的3'-RACE | 第72-73页 |
| ·ADH cDNA的5'-RACE | 第73-74页 |
| ·龙眼EC中ADH cDNA全长及其序列分析 | 第74-78页 |
| ·Adh基因在龙眼合子胚发育过程中的表达 | 第78-79页 |
| ·Lc.A和Lc.B的肽指纹数据与cDNA理论翻译产物的氨基酸序列比对 | 第79-81页 |
| ·龙眼EC中ADH cDNA在E.coli的表达 | 第81-83页 |
| ·龙眼EC中ADH的cDNA开放阅读框的扩增及插入表达载体pET-15b | 第81-82页 |
| ·龙眼EC中ADH在大肠杆菌BL21中的表达 | 第82-83页 |
| 3 小结与讨论 | 第83-84页 |
| ·首次从龙眼克隆得到ADH的cDNA | 第83页 |
| ·龙眼合子胚中Adh基因的表达 | 第83页 |
| ·ADH的原核表达 | 第83-84页 |
| 总结 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-89页 |
| 附录(Ⅰ) | 第89-97页 |
| 附录(Ⅱ) | 第97-103页 |
| 附录(Ⅲ) | 第103-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 在学期间发表的相关论文 | 第110页 |
